跑臺運動對成年脊髓損傷小鼠運動功能及運動皮質mTOR信號通路的影響

詹祖雄，譚波濤，王昀杭，趙秦，劉媛，李森，龍在云，楊策，殷櫻*

1重慶醫科大學附屬第二醫院康復醫學科，重慶 400010；2陸軍軍醫大學特色醫學中心(大坪醫院)特殊環境戰傷防治研究室/創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042

脊髓損傷是一種破壞性的中樞神經系統疾病，發病率不斷上升[1]。脊髓損傷后機體功能缺失嚴重，給患者及其家庭帶來了沉重的心理和經濟負擔。目前康復訓練仍是促進脊髓損傷后功能恢復的主要手段[2-3]，因其價格低廉、安全、無創而被患者廣泛接受。跑臺運動是一種常見的康復訓練方式，可提升機體耐力，且具有潛在的促進神經損傷修復的作用。既往研究發現，跑臺運動可促進脊髓損傷后脊髓神經營養因子，如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)等的表達[4-5]，繼而影響對應受體如酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)、IGF-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)等的磷酸化，激活下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路[6-7]，從而有利于神經元的存活。最近研究發現，mTOR信號通路激活是促進成體內源性軸突再生的重要影響因素[8-9]。因此，采用跑臺運動干預神經損傷具有良好的應用前景，但其對大腦運動皮質的影響尚不清楚。有研究發現，跑臺運動后，成年小鼠運動皮質中神經營養因子表達增加、mTOR信號通路激活且運動學習能力增強[10]。本團隊前期研究發現，跑輪運動(以最大運動速度的50%)后，成年小鼠運動皮質中BDNF、IGF-1表達增加，且神經傳導速度加快[11]。本研究探討跑臺運動對脊髓損傷小鼠運動皮質中神經營養因子表達及mTOR信號通路的影響，以期為脊髓損傷治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 BCA蛋白定量試劑盒、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(美國Thermo公司)；BDNF、磷酸化酪氨酸激酶受體B(phosphorylated tyrosine kinase receptor B，p-TrkB)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)、磷酸化核糖體S6蛋白(phosphorylated ribosomal S6 protein，p-S6)、磷酸化胰島素樣生長因子1受體(phosphorylated insulinlike growth factor 1 receptor，p-IGF-1R)、蛋白激酶C-γ(protein kinase C-γ，PKC-γ)抗體(美國CST公司)；IGF-1抗體(上海Absin公司)；β-actin抗體(武漢Proteintech公司)；神經元特異核蛋白(neuronspecific nuclei protein，NeuN)抗體(美國Millpore公司)；熒光二抗(美國Jackson實驗室)。小型垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)；化學發光成像儀(上海Tanon公司)；冷凍切片機(美國Thermo公司)；A1+R激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 實驗動物及分組 3 0 只健康成年雌性C57BL/6J小鼠(6～8周齡，體重20～25 g)購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，于20～25 ℃、40%～60%相對濕度、12 h/12 h晝夜節律的SPF環境下分籠飼養，自由攝入食物和水。隨機分為假手術組、模型組與跑臺運動組，每組10只。假手術組僅打開椎板，模型組和跑臺運動組給予C5鉗夾損傷。本研究經重慶醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審批[(2020)161]，所有操作均遵守《醫學實驗動物管理實施細則》的要求。

1.3 C5鉗夾損傷模型制備 模型組和跑臺運動組小鼠進行3 d跑臺運動預訓練后，制備脊髓損傷模型。腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，備皮消毒后俯臥位固定于手術臺上；使用27號手術刀切開頸部皮膚，鈍性分離肌肉與筋膜，暴露椎板。定位C5棘突，用咬骨鉗移除椎板，避免傷及軟脊膜；使用26號針在脊髓后角灰質部分刺破軟脊膜，用改良FST Dumont 5號手術鉗沿針孔刺入脊髓背角灰質(約1 mm)，對C5背側皮質脊髓束(dorsal corticospinal tract，dCST)進行鉗夾損傷，維持15 s，重復1次；再次將改良FST Dumont 5號手術鉗的一側尖端刺入左側脊髓背側(約0.8 mm)，另一側尖端置于脊髓外側，鉗夾紅核脊髓束(rubro-spinal tract，RST)和皮質脊髓側束，維持15 s，重復1次(圖1A)。損傷后顯微鏡下可見一條明顯的鉗夾損傷痕跡(圖1B)。術后逐層縫合頸部肌肉及皮膚，并用碘伏涂抹消毒。待小鼠蘇醒，觀察無異常后放回飼養籠。每日觀察小鼠一般情況，有排尿困難的小鼠給予人工擠壓膀胱，協助尿液排出。

圖1 C5鉗夾損傷小鼠模型及傷后損傷痕跡Fig.1 Schema of C5 crush injury model and scar post-injury

1.4 跑臺運動 造模1周后開始正式跑臺運動。訓練期間對小鼠進行最大運動速度檢測，具體為以9 m/min的速度熱身5 min，然后以a=1 m/min2的加速度逐漸加速，直至小鼠停留在電擊區域被連續電擊大于10次且不再跑動[12]，則認為其力竭，定義此時的速度為最大運動速度。以最大運動速度的50%進行跑臺運動，30 min/次，1次/d，5 d/周，持續4周；假手術組和模型組小鼠僅置于跑步機上，不進行運動。

1.5 C5鉗夾損傷模型驗證 PKC-γ可特異性標記dCST，C5鉗夾損傷后，由上至下的皮質脊髓束無法下行至胸段dCST區域而使PKC-γ染色呈陰性，因此對小鼠胸段脊髓冠狀切片進行免疫熒光染色可鑒定造模是否成功，對小鼠頸段脊髓矢狀切片進行免疫熒光染色可確定損傷范圍。

跑臺運動結束后，取所有小鼠頸段和胸段脊髓，于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定，不同濃度蔗糖溶液(18%、24%、30%)梯度脫水；經OCT包埋后使用冷凍切片機分別進行矢狀位和冠狀位切片；經PBS洗滌、0.3% Triton X-100通透、5%驢血清封閉后，加入GFAP(1:2000)、PKC-γ(1:200)一抗孵育；洗滌后，加入Alex Fluor-488、Alex Fluor-594偶聯驢抗兔IgG(1:500)二抗孵育，封片后采集免疫熒光圖像。若傷后脊髓胸段dCST區域PKC-γ染色呈陽性，則表明C5鉗夾損傷模型失敗，將該小鼠剔除。1.6 行為學檢測 分別于傷前(0 d)及傷后3 d、1周、3周和5周進行水平樓梯和圓筒攀爬實驗。實驗正式開始前，將動物放入水平樓梯和圓筒內適應環境并預訓練3 d(1次/d)。

1.6.1 后肢踏步運動功能檢測 將小鼠放入一個固定場所，觀察其后肢運動、軀干位置和穩定性、步態協調性、爪及尾的位置等變化，采用BMS(Basso Mouse Scale)評定小鼠后肢踏步運動功能[13]，完全截癱為0分，正常為9分。于傷前(0 d)及傷后1、3、5、7、14 d分別進行傷前基線水平和傷后水平檢測。

1.6.2 水平樓梯實驗 水平樓梯跑道由兩塊透明有機玻璃板(80 cm×50 cm)和若干金屬橫梯構成，每個橫梯間距1.3 cm。將動物飼養籠置于跑道末端接取動物，使用攝像機記錄小鼠跑過31個橫梯的情況。每次實驗前隨機抽掉5根橫梯使跑道間隔不規律分布(最大間隔為2個橫梯)。實驗結束后，逐幀分析左前、左后肢踩空和滑落橫梯的情況，計算錯誤步數占總步數的比率[14]。

1.6.3 圓筒攀爬實驗 將小鼠放置在透明有機玻璃圓筒(直徑15 cm、高20 cm)內，使用攝像機記錄直立狀態下使用前肢攀爬圓筒壁的偏好程度，以直立狀態下前肢接觸筒壁，然后放回地面記為一組。實驗結束后，分析前10次圓筒攀爬情況，最長觀察15 min[14]，計算使用左前肢進行攀爬的比率。

1.7 Western bloはing檢測運動皮質中BDNF、IGF-1、p-TrkB、p-IGF-1R、p-Akt、p-S6的表達 跑臺運動結束后，各組取4只小鼠灌注，取右側大腦運動皮質，稱重后放入勻漿器中，加入適量RIPA裂解液(每1 mg組織加入5 μl裂解液)進行研磨和超聲破碎；置于冰上裂解20～30 min，12 000×g離心20 min，取上清；BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸10 min；取30～50 μg蛋白上樣，行SDS凝膠電泳，并轉至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉1～2 h；加入BDNF(1:1000)、IGF-1(1:500)、p-TrkB(1:1000)、p-IGF-1R(1:1000)、p-Akt(1:1000)、p-S6(1:1000)一抗4 ℃孵育過夜；次日洗膜，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1:2000)和山羊抗兔IgG(1:3000)二抗室溫孵育1 h；洗膜，使用ECL化學發光成像儀(Tanon)顯影曝光，使用ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。實驗重復5次。

1.8 免疫熒光染色檢測運動皮質中S6蛋白的磷酸化水平 跑臺運動結束后，各組取4只小鼠灌注，取出完整大腦，于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，蔗糖梯度(18%、24%、30%)脫水、OCT組織包埋，采用冠狀位切片，厚度18 μm。

用0.01 mol/L PBS洗滌切片5 min×3次，0.3%TritonX-100室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次，5%驢血清封閉45～60 min，加入NeuN(1:800)、p-S6(1:200)一抗室溫孵育過夜；次日用0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次，加入Alex Fluor-488偶聯驢抗豚鼠IgG(1:500)、Alex Fluor-594偶聯驢抗兔IgG(1:500)二抗37 ℃下孵育45 min；用0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次，晾干，使用防淬滅封片劑封片，于共聚焦顯微鏡下采集圖像，ImageJ軟件分析p-S6染色熒光強度。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。定量數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 C5鉗夾損傷模型驗證結果 頸段脊髓免疫熒光染色結果顯示，C5鉗夾損傷后，小鼠頸髓損傷區域大量星形膠質細胞增生，可見明顯瘢痕形成及損傷(圖2A)。PKC-γ免疫熒光染色結果顯示，損傷小鼠胸段dCST區域PKC-γ染色呈陰性，而正常小鼠呈陽性(圖2B)。根據PKC-γ免疫熒光染色結果，跑臺運動組和模型組各剔除2只小鼠，最終跑臺運動組和模型組各入組8只，假手術組數量與此保持一致。

圖2 C5鉗夾損傷后頸段和胸段脊髓免疫熒光染色結果Fig.2 Cervical and thoracic spinal cord of mice after C5 crush injury (Immunofluorescence staining)

2.2 行為學檢測結果

2.2.1 各組小鼠C5鉗夾損傷前后BMS評分比較

傷前三組小鼠BMS評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。傷后1、3 d，模型組和跑臺運動組BMS評分均低于假手術組(P<0.0001)，但跑臺運動組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。傷后7 d，模型組和跑臺運動組BMS評分均恢復至基線水平(圖3)。

圖3 C5鉗夾損傷14 d內各組小鼠BMS評分(n=8)Fig.3 BMS scores of mice in each group within 14 days after C5 crush injury (n=8)

2.2.2 跑臺運動對C5鉗夾損傷后小鼠水平樓梯實驗左側肢體錯誤率的影響 傷前，假手術組、模型組與跑臺運動組左前、左后肢錯誤率均較低，且差異無統計學意義(左前肢錯誤率：2.7%±1.7%vs. 1.3%±1.2%vs. 1.4%±0.9%，P>0.05；左后肢錯誤率：1.6%±1.4%vs. 1.1%±1.2%vs. 1.1%±0.9%，P>0.05)。傷后3 d、1周、3周和5周，模型組和跑臺運動組左前、左后肢錯誤率均高于假手術組(P<0.001)。傷后3 d和1周，跑臺運動組與模型組左前、左后肢錯誤率比較差異無統計學意義(P>0.05)；傷后3周和5周，跑臺運動組左前、左后肢錯誤率明顯低于模型組(P<0.001) (圖4A)。

2.2.3 跑臺運動對C5鉗夾損傷后小鼠圓筒攀爬實驗左前肢使用率的影響 傷前，假手術組、模型組與跑臺運動組小鼠使用左前肢攀爬圓筒壁的頻率相當(25.8%±1.6%vs. 25.6%±1.7%vs. 25.4%±1.2%，P>0.05)。傷后3 d和1周，模型組與跑臺運動組左前肢使用率均低于假手術組(P<0.001)，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。傷后3周和5周，模型組左前肢使用率仍低于假手術組(P<0.001)，而跑臺運動組與假手術組左前肢使用率比較差異無統計學意義(P>0.05)，但高于模型組(P<0.05) (圖4B)。

圖4 C5鉗夾損傷前后各組小鼠行為學檢測結果(n=8)Fig.4 Behavioral test of mice in each group before and after C5 crush injury (n=8)

2.3 跑臺運動對C5鉗夾損傷后小鼠運動皮質BDNF、IGF-1表達及相應受體TrkB、IGF-1R磷酸化的影響 Western blotting檢測結果顯示，經4周跑臺運動后，與假手術組比較，模型組和跑臺運動組小鼠運動皮質BDNF、IGF-1蛋白相對表達水平及TrkB、IGF-1R磷酸化水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，跑臺運動組小鼠運動皮質BDNF、IGF-1蛋白相對表達水平及TrkB、IGF-1R磷酸化水平明顯升高(P<0.01) (圖5)。

圖5 C5鉗夾損傷后各組小鼠運動皮質BDNF、IGF-1、p-TrkB、p-IGF-1R蛋白的表達(n=4)Fig.5 Expressions of BDNF, IGF-1, p-TrkB and p-IGF-1R in motor cortex of mice in each group after C5 crush injury (n=4)

2.4 跑臺運動對C5鉗夾損傷后小鼠運動皮質mTOR信號通路關鍵蛋白Akt、S6及神經元細胞S6蛋白磷酸化的影響 Western blotting檢測結果顯示，經4周跑臺運動后，與假手術組比較，跑臺運動組和模型組小鼠運動皮質Akt、S6磷酸化水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，跑臺運動組小鼠運動皮質Akt、S6磷酸化水平明顯升高(P<0.01) (圖6A)。

免疫熒光染色結果顯示，與假手術組比較，模型組和跑臺運動組小鼠運動皮質神經元細胞內p-S6染色熒光強度降低(21.21±5.38、44.62±8.39vs.61.20±7.20，P<0.01)；與模型組比較，跑臺運動組小鼠運動皮質神經元細胞內p-S6染色熒光強度增高(P<0.01，圖6B)。

圖6 C5鉗夾損傷后各組小鼠運動皮質Akt、S6及神經元細胞中S6蛋白磷酸化情況(n=4)Fig.6 Phosphorylation of Akt, S6 and neuronal S6 in motor cortex of mice in each group after C5 crush injury (n=4)

3 討 論

運動訓練是促進脊髓損傷、腦損傷、腦卒中等神經損傷后運動功能恢復的有效手段，然而其促進損傷后功能恢復的分子機制尚未明確。本研究采用C5脊髓鉗夾損傷模型[15]，以跑臺運動作為干預方式，結果顯示在跑臺運動后脊髓損傷小鼠運動皮質中BDNF、IGF-1表達增加，其受體TrkB、IGF-1R以及下游mTOR信號通路關鍵蛋白Akt、S6的磷酸化水平增高，水平樓梯實驗左前、左后肢錯誤率降低，圓筒攀爬實驗左上肢使用率增高，該結果為運動促進神經損傷的修復提供了新的證據。

C5脊髓鉗夾損傷模型不同于既往常見的脊髓損傷模型如脊髓撞擊挫裂傷、脊髓背側半切等[16]，這些模型存在不能特異性損傷脊髓傳導束、損傷范圍大、不便進行行為學評價等不足。Hilton等[14]發現，在C4和C6節段分別損傷小鼠背外側束后，后者前肢運動功能自我恢復明顯，提示C6節段背外側束損傷可能不利于觀察傷后的行為學變化；Hollis等[17]發現，控制小鼠前肢的頸髓節段為C5及以下節段。因此，本研究選擇在C5節段損傷dCST和左側RST。CST和RST對嚙齒動物精細運動功能的控制十分重要，影響小鼠的隨意運動[18]，損傷dCST和左側RST后主要影響左前肢的精細運動，而對小鼠右前肢及下肢步行功能影響較小，既能滿足損傷小鼠進行一定強度跑臺運動的要求，又便于觀察干預后運動功能的恢復情況。

國內外研究發現，運動促進神經損傷修復可能與上調神經營養因子的表達有關[4,19-20]。跑臺運動可增加胸段脊髓損傷大鼠脊髓內BDNF、膠質細胞源性神經營養因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)、神經營養因子3/4(neurotrophin-3/4，NT-3/4)、IGF-1等的表達，減少神經元細胞凋亡，挽救殘存的脊髓運動神經元[5,21]。Li等[22]發現，阻斷脊髓BDNF-TrkB信號通路可抑制運動訓練對不完全性脊髓損傷大鼠運動功能恢復及脊髓可塑性的促進作用。IGF-1在中樞神經系統的生長、發育、成熟、損傷修復，以及神經可塑性等方面起著重要作用[7]。Trejo等[23]發現，IGF-1是運動誘導的海馬神經發生增強的重要中介，影響神經可塑性。Glasper等[24]發現，運動誘導的樹突棘密度變化可因IGF-1被阻斷而消除。Liu等[25]發現，跑步運動可增加脊髓損傷大鼠骨骼肌中IGF-1的表達，有效延緩損傷后的肌肉萎縮。Marchetto等[26]發現，IGF-1可通過介導自閉癥譜系疾病(autism spectrum disorders，ASD)衍生的異常神經和突觸發生而實現對神經元網絡缺陷的挽救。本研究發現，跑臺運動可促進脊髓損傷小鼠腦運動皮質神經營養因子BDNF、IGF-1的表達，提示皮質神經營養因子上調也是脊髓損傷小鼠運動功能恢復的機制之一。

BDNF與受體TrkB結合后，可促進TrkB的磷酸化[27]，進一步激活多種酶，如磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylin-ositol-3 kinase，PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ，PLC-γ)等，導致下游PI3K-Akt-mTOR、MAPK/Ras及PLC-γ依賴性信號通路等分別被激活，這與神經元存活與凋亡、神經可塑性、神經再生與分化等密切相關[6,28-29]。類似的，IGF-1與IGF-1R結合后，下游PI3K-Akt-mTOR與MAPK/ERK信號通路被激活，可從多個方面調控細胞的存活[30]。mTOR作為TrkB和IGF-1R共同的下游作用靶點，廣泛參與介導運動獲益的過程[31]。mTOR可影響基因轉錄和蛋白質的合成，調節細胞的生長、凋亡等，對運動、神經發育等具有重要調節作用[8,32]。Chen等[10]發現，運動訓練增強正常小鼠運動學習能力與運動皮質mTOR信號通路激活有關。Liu等[33]發現，耐力訓練可激活各年齡段大鼠腦皮質mTOR信號通路，改善皮質突觸可塑性。Jung等[5]發現，運動訓練可能通過激活脊髓PI3KAkt-mTOR信號通路而抑制受傷大鼠脊髓細胞的凋亡，進而促進運動功能恢復。本課題組前期研究發現，激活皮質mTOR信號通路的聯合任務導向性運動訓練可明顯改善脊髓損傷小鼠的上肢精細運動功能[34]。新近研究發現，可卡因成癮的小鼠經1周跑步運動干預后，可恢復由可卡因誘導的皮質突觸形成缺陷，這與皮質mTOR信號通路激活引起的體內突觸傳遞、皮質椎體神經元自發活動及運動學習能力增強密切相關[35]，提示mTOR信號通路的激活可能與運動誘導的正向效應存在聯系。本研究發現，跑臺運動干預后脊髓損傷小鼠運動皮質TrkB、IGF-1R及mTOR信號通路關鍵蛋白Akt和S6的磷酸化水平均明顯升高，提示跑臺運動促進脊髓損傷后功能恢復可能與運動皮質mTOR信號通路激活有關

綜上所述，跑臺運動可增高C5脊髓鉗夾損傷小鼠運動皮質BDNF、IGF-1的表達及其受體的磷酸化水平，促進mTOR信號通路的激活，這些分子表達的變化可能介導了運動誘導的功能恢復，該結果為脊髓損傷的康復治療提供了理論依據。但本研究僅觀察現象，具體分子機制有待使用mTOR抑制劑進行驗證；且脊髓損傷后小鼠持續性功能喪失及恢復困難的原因不僅包含大量軸突斷裂，還存在脫髓鞘等結構改變，后續研究須綜合探討跑臺運動干預對軸突再生、出芽、再髓鞘化及神經可塑性等方面的影響。