miR-205在宮頸鱗癌中的表達及其對癌細胞遷移、侵襲能力的影響

劉建兵，林曉雨，李文龍，王偉，王文豪，崔小華，郝建卿，李莉，郝敏*

1山西醫科大學第二醫院婦產科，山西太原 030001；2山西醫科大學基礎醫學院醫學細胞生物與遺傳學教研室，山西太原 030001

宮頸癌是一種發病率和致死率均較高的婦科腫瘤[1-2]。高危型人乳頭瘤病毒的持續感染是公認的誘發宮頸癌變的主要因素[3-4]。現有研究發現，Epstein-Bar病毒、陰道微生物菌群、葉酸缺乏及化學致癌物等因素均與宮頸癌的發生發展有關[3,5-6]。微小RNA(miRNA，miR)是一段由20～24個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，一般通過與靶基因結合后的相互作用而發揮調控功能，涉及30%以上的人類基因[7-8]。目前發現宮頸癌中有近百種miRNA存在異常表達，如miR-27b、miR-196a、miR-21、miR-590等呈高表達[9-12]，miR-506、miR-200b、miR-183、miR-125b等呈低表達[13-16]。差異表達的miRNA通過廣泛參與宮頸癌細胞的增殖、侵襲、轉移、化療耐藥、放療抵抗等過程，在宮頸癌的發生、發展及預后中發揮重要的作用[17]，但目前能應用于臨床診斷及作為治療靶標的關鍵miRNA還很少。本研究擬篩選宮頸癌中異常表達的miRNA，并通過細胞及分子生物學方法鑒定關鍵miRNA的功能機制，以探討宮頸癌發生發展的機制，并尋找可用于宮頸癌診斷及治療的新靶標。

1 材料與方法

1.1 樣本信息及差異表達分析 從腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫中下載宮頸鱗癌患者的臨床信息及miRNA不同亞型表達量數據，包括254個腫瘤樣本組織和3個鄰近的非腫瘤樣本組織，并在R軟件中進行歸一化處理。采用R軟件中的“limma”包分析并篩選差異表達的miRNA，篩選標準為差異倍數>2.5及P<0.01。P值經錯誤發現率(FDR)校正。

1.2 宮頸鱗癌樣本及癌細胞株 選取2021年6－9月在山西醫科大學第二醫院進行手術治療的21例宮頸鱗癌患者。納入標準：初次確診為宮頸鱗癌；治療前未進行化療、放療及免疫治療等；接受宮頸癌切除術。收集手術切除的21例宮頸鱗癌組織及13例癌旁組織，將標本保存于4%多聚甲醛溶液及液氮中。本研究經山西醫科大學倫理委員會審查通過(2021SLL044)。人宮頸癌細胞系HeLa及SiHa細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，培養于DMEM培養基(含10%FBS、1%雙抗)中，于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中生長，備用。

1.3 細胞轉染 對照(NC)組、miR-205組，miR-205抑制劑對照組，miR-205抑制劑組以及si-IL-32組細胞，分別利用Lipofectamine 2000轉染NC序列(UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG)、miR-205 mimics序列(GACUCCGGUGGAAUGAAGGAUU)、miR-205 inhibitor NC序列(CAGUACUUUUGUGUAG UACAA)、miR-205 inhibitor序列(CAGACUCCGGUG GAAUGAAGGA)及IL-32 siRNA序列(GGCUUGAUU ACUCUCUAUATT)。

1.4 原位雜交法檢測癌組織中miR-205的表達 采用原位雜交法檢測癌組織中miR-205的表達，以癌旁組織作為對照。將人宮頸鱗癌組織用4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，蛋白酶K處理，室溫下用醋酸酐、三乙醇胺溶液孵育10 min，加入地高辛標記的RNA探針[5'-CAG(+A)C(+T)CCGG(+T)GGAA(+T)GA(+A)GGA-Dig-3']，4 ℃孵育過夜。次日用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液沖洗，并用堿性磷酸酶顯色液處理至顯色，水洗殘液，乙醇脫水，封片，拍照。

1.5 qRT-PCR法檢測miR-205及IL-32的表達 提取總RNA，并要求其光密度(OD)260/OD280為1.8～2.0；將RNA進行反轉錄，得到模板cDNA；以cDNA為模板，構建PCR體系，采用兩步法進行PCR擴增。引物序列如下。miR-205：反轉引物RT-205 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCAGACT-3'；擴增引物正向5'-AATTGTCCTTCATTCCACCGG-3'，反向5'-GTGC AGGGTCCGAGGT-3'；IL-32正向5'-TCTCAGTGGA GCTGGGTCAT-3'，反向5'-CCAACCCCTGAGCAGAA GTA-3'；U6正向5'-CGCヰCGGCAGCACATATAC-3'，反向5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH正向5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3'，反向5'-TTCACACCCATGACGAACAT-3'。以人U6基因或GAPDH作為內參照，目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。ΔΔCt=(目的基因Ct－內參照基因Ct)處理組－(目的基因Ct－內參照基因Ct)對照組。

1.6 細胞增殖、遷移及侵襲能力檢測 (1)細胞增殖檢測：采用CCK-8法，取適量細胞，置于96孔板，每組重復5孔，分別于培養0 h和48 h每孔添加10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標儀測定450 nm處的OD值，計算細胞活力。(2)細胞遷移及侵襲能力檢測：采用Transwell模型，將Transwell小室放入預先每孔加有600 μl培養基(含10%血清)的24孔板內，在Transwell的內室(侵襲實驗中的Transwell小室需提前鋪Matrigel基質膠)加入適量細胞，培養一定時間后，取出小室，擦掉內室細胞，利用4%多聚甲醛溶液固定小室外細胞，伊紅或結晶紫染色后，于顯微鏡下觀察、計數、拍照。

1.7 miR-205對IL-32mRNA表達的調節作用 在宮頸癌HeLa及SiHa細胞中，檢測過表達或降低miR-205表達后IL-32的表達情況。比較IL-32啟動子與miR-205序列，構建IL-32啟動子報告載體，將IL-32啟動子報告載體與NC或miR-205mimics序列分別共轉染于HeLa細胞中，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(海腎螢光素酶基因為報告基因，螢火蟲螢光素酶基因為內參照基因，美國Promega公司)檢測相對熒光素酶活性。

1.8 Western blotting法檢測侵襲相關蛋白的表達將HeLa和SiHa細胞各分為對照組及si-IL-32組，提取細胞總蛋白，測定OD562nm值，根據標準曲線法測得蛋白濃度。取30～50 μg蛋白樣品，變性，SDSPAGE凝膠電泳，轉膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，孵育一抗過夜；磷酸鹽緩沖溶液沖洗3～5次，孵育二抗1 h；磷酸緩沖溶液沖洗3～5次，按化學發光試劑盒要求進行曝光顯影(取溶液A、B各1 ml，避光條件下配制發光液，滴加適量發光液，使其與蛋白膜充分接觸，反應1 min后，進入暗室顯影、定影)。所用抗體如下：兔源MMP-2、MMP-9(1:1000，美國Proteintech公司)及兔源GAPDH(1:5000，美國Bioworld公司)。以GAPDH為內參，通過條帶灰度分析計算蛋白相對表達量。

1.9 統計學處理 采用Excel 2007軟件進行統計學分析。計量資料以表示，宮頸癌組和癌旁組的比較采用配對t檢驗，實驗組與對照組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 篩選宮頸鱗癌差異表達miRNA 生物信息學分析顯示，宮頸鱗癌中具有表達差異的miRNA共106個，其中70個上調，36個下調。在差異表達的miRNA中，miR-205表達量變化最大，差異倍數為8.414(圖1，表1)。

表1 宮頸鱗癌中表達上調及下調前5位的miRNATab.1 The top five up-regulated and down-regulated miRNAs in cervical squamous cell carcinoma

圖1 宮頸鱗癌中差異表達的miRNA火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed miRNAs in cervical squamous cell carcinoma

2.2 宮頸癌組織中m i R-2 0 5 的表達水平 在TCGA數據庫中，與宮頸正常組織miR-205表達量(55.60±3.6)比較，宮頸鱗癌組織的miR-205表達量(12 122.59±9000.7)明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)。原位雜交檢測結果顯示，miR-205在人宮頸鱗癌組織中呈陽性表達(藍色)，而在癌旁組織中表達很弱，甚至不表達(圖2B)。宮頸鱗癌臨床標本癌組織的miR-205表達量明顯高于癌旁組織[(1.86±0.19)vs. 1.00，P<0.05，圖2C]。2.3 過表達miR-205對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響 HeLa細胞轉染實驗結果顯示，與對照組比較，miR-205組miR-205的表達水平明顯升高(P<0.05，圖3A)；CCK-8法檢測結果顯示，與對照組比較，miR-205組細胞活力明顯升高(P<0.05，圖3B)；Transwell法檢測結果顯示，與對照組比較，miR-205組能夠遷移或侵襲過Transwell小室的細胞數量明顯增多(P<0.01，圖3C)。

圖2 宮頸鱗癌與正常組織中miR-205的表達情況Fig.2 The expression of miR-205 in normal tissue and cervical squamous cell carcinoma

圖3 miR-205過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.3 The effect of over-expressed miR-205 on proliferation, migration and invasion of cervical cancer HeLa cells

2.4 miR-205對IL-32mRNA表達的調節作用 與對照組比較，miR-205組miR-205表達量明顯升高(P<0.05，圖4A)；與miR-205抑制劑對照組比較，miR-205抑制劑組miR-205表達量明顯降低(P<0.05，圖4B)。與對照組比較，miR-205組IL-32mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05，圖4C)； 與miR-205抑制劑對照組比較，miR-205抑制劑組IL-32mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05，圖4D)。在臨床標本中，與癌旁組織比較，宮頸鱗癌組織中IL-32mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05，圖4E)。與IL-32啟動子報告載體+NC組比較，IL-32啟動子報告載體+miR-205組的相對熒光活性明顯升高(P<0.05，圖4F)。

圖4 miR-205對IL-32 mRNA表達的調節作用Fig.4 Regulating effect of miR-205 and on the expression of IL-32 mRNA

2.5 miR-205和IL-32對宮頸癌細胞侵襲及侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9表達的影響 與對照組比較，si-IL-32組細胞IL-32mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05，圖5A、B)。Transwell法檢測結果顯示，降低miR-205表達后遷移過Transwell小室的細胞數量明顯變少(P<0.05，圖5C)；si-IL-32組能夠侵襲過Transwell小室的細胞數量也明顯少于對照組(P<0.05，圖5D)。Western blotting檢測結果顯示，si-IL-32組MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達量明顯低于對照組(P<0.05，圖6)。

圖5 miR-205和IL-32對宮頸癌細胞侵襲的影響Fig.5 The effect of miR-205 and IL-32 on the invasion of cervical cancer cells

3 討 論

宮頸癌中有近百種miRNA存在異常表達，但目前能應用于臨床診斷及作為治療靶標的關鍵miRNA還很少。本研究經篩選獲得了宮頸癌中共106個差異表達的miRNA，其中miR-205表達明顯上調，且變化量最大。本研究發現，miR-205在宮頸癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，提示miR-205可能對宮頸癌的發生發展起重要作用。miR-205是一個非常保守的非編碼RNA分子，在多種癌癥的發生發展中異常表達，在不同類型的癌癥中，既可以充當致癌因子，又可以充當抑癌因子的角色[18]。在宮頸癌的研究中，關于miR-205的功能也有不同報道。有研究發現，miR-205促進了宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲[19-21]，也有研究顯示miR-205能夠抑制宮頸癌細胞的增殖及侵襲[22-23]。本研究證實，miR-205能促進宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，為闡明miR-205在宮頸癌中的作用提供了新證據。

人IL-32起初發現于活化的NK細胞及T細胞，主要表達于免疫細胞及上皮細胞，是一種促炎細胞因子[24]。IL-32在多種類型的癌癥中異常表達，能夠通過促炎效應、抗病毒感染、促血管生成等方式及途徑參與調控腫瘤的發生發展，但其在宮頸癌中的作用研究較少。既往發現IL-32對宮頸癌的發展具有抑制作用[25-26]，但Lee等[25]發現IL-32高表達與宮頸癌的進展顯著相關，隨著人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染，使炎癥持續，可能會促進宮頸發生癌變。IL-32可誘導腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的表達，進而促進炎癥反應[27]。Lee等[25]證實，IL-32可促進IL-1β、TNF-α及IL-18等炎性因子的表達。本研究發現，miR-205可促進炎性因子IL-32的表達，進而增強MMP-2、MMP-9的表達，促進宮頸癌細胞的侵襲。有研究發現，miRNA與炎性因子能夠相互作用：一方面，miRNA靶向炎癥執行者，調節炎癥反應；另一方面，炎癥信號可改變miRNA的表達，進而調節炎性因子表達，破壞促腫瘤與抗腫瘤信號轉導的平衡，進而在惡性轉化中發揮重要的調控作用[28]。上述結果提示，miR-205可能通過調控炎性因子IL-32的表達在宮頸癌的發生發展中發揮重要的促進作用。

經典理論認為，miRNA對靶基因具有負調控作用，但有研究發現miRNA在基因表達調控中也有正向調控的情況發生。Vasudevan等[29]證實miRNA可從對基因表達的抑制作用轉變為活化作用；Majid等[30]發現，miR-205能夠結合于IL-24及IL-32的啟動子區，并誘導靶基因mRNA和蛋白的高表達；Kim等[31]發現，口腔癌中miR-205能夠直接上調IL-24的表達；Xiao等[32]發現，位于細胞核內的miRNA可起到激活基因轉錄的作用；本課題組前期研究也發現，miR-205能夠直接上調靶基因CHN1的表達[21]。由此看來，miRNA對靶基因的調控機制除了經典的負調控以外，還可能有正調控作用。在miR-205的調控模式中已經多次發現正調控的現象，表明miR-205對靶基因調控機制較為復雜。本研究發現，在宮頸癌細胞中miR-205與IL-32mRNA的表達變化一致，原位雜交實驗顯示miR-205可能在細胞核中高表達；本實驗還證實miR-205可通過與IL-32啟動子相互作用提高IL-32mRNA的表達量。這為后續研究miR-205的復雜作用機制指明了方向，也再次證實了miR-205與IL-32的調控關系，但miR-205通過調控IL-32的表達影響宮頸癌發生發展的具體機制還需進一步深入研究。

綜上所述，在宮頸鱗癌中存在異常表達的miRNA，其中miR-205明顯高表達，可能通過上調IL-32的表達調節MMP-2和MMP-9的表達水平，從而促進癌細胞的增殖、遷移及侵襲。