HPLC-QqQ-MS法同時測定八味小檗皮膠囊中25種成分的含量Δ

易 歡，彭 芳，謝雨宸，茍曉玲，丁 銀，范 剛#（.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 637；.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 637）

八味小檗皮膠囊為常用的藏藥復方制劑，由小檗皮、蓽茇、紅花、余甘子、甘草、熊膽粉、人工麝香、京墨8味藥組成，具有消炎止痛、固精止血的功效，臨床上常用于治療尿路感染、尿痛、白濁、血尿、滑精等疾病。八味小檗皮膠囊處方來源于八味小檗皮散，《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥分冊》對八味小檗皮散的制法、性狀、檢查等進行了描述[1]，但無鑒別、含量測定等內容，難以進行有效的質量控制。目前，雖已有文獻采用高效液相色譜法測定了八味小檗皮散中沒食子酸和小檗堿的含量[2－3]和八味小檗皮膠囊中鹽酸小檗堿的含量[4]，但由于該藥成分復雜，且復方制劑具有多成分、多靶點的作用特點，加之羥基紅花黃色素A、甘草苷、鞣花酸、熊去氧膽酸、膽酸等成分已被證明具有明顯的抗炎、抗氧化、降血糖、免疫調節(jié)等活性[5－8]。因此，建立多成分的含量測定方法有利于控制八味小檗皮膠囊的生產投料和內在質量，也可為其藥效物質基礎研究奠定基礎。

高效液相色譜串聯質譜技術具有靈敏度高、分離能力強、分析范圍廣等特點，可對藥材中的微量成分或不易分離的成分進行定性定量分析[9－10]。本研究充分利用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜（high-performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-QqQ-MS）技術的分析優(yōu)勢，首次對藏藥八味小檗皮膠囊中的25種成分（均為8味藥的活性成分）進行了定量測定，旨在為其成分分析提供方法學參考，也為今后探究其藥效物質基礎提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260 型HPLC 儀、G6420A型三重四極桿質譜儀（美國Agilent 公司），Sartorius CPA225D型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，CQ-250 型超聲清洗器[必能信超聲（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

槲皮素對照品（批號100081-200907）、膽酸對照品（批號100078-200414）、藥根堿對照品（批號110733-201108）、蘆丁對照品（批號080-9303）、柯里拉京對照品（批號111623-200302）、阿魏酸對照品（批號0773-9910）均購于中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸對照品（批號MUST-13040103）購于成都曼斯特生物科技有限公司；甘氨膽酸對照品（批號G131002）、甘氨脫氧膽酸對照品（批號G113438）、甘氨鵝脫氧膽酸對照品（批號S167765）均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊去氧膽酸對照品（批號DST200823-076）、胡椒堿對照品（批號DST200109-043）、甘草酸對照品（批號DSTDG000601）、訶子鞣酸對照品（批號DST200927-064）、甘草素對照品（批號DSTDG001001）、蟾蜍色胺對照品（批號DST201022-175）均購于成都德思特生物技術有限公司；木蘭花堿對照品（批號PS170717-08）、鞣花酸對照品（批號PS010827）、羥基紅花黃色素A 對照品（批號PS000745）均購于成都普思生物科技股份有限公司；甘草苷對照品（批號G-009-121124）、綠原酸對照品（批號RFS-L00701908029）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司；巴馬汀對照品（批號H-015-150808）、小檗堿對照品（批號Y-035-150818）均購于四川賽因斯特生物科技有限公司；阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和蟾蜍特尼定對照品均為本課題組自制[11]。所有對照品純度均大于96.0%。色譜級甲醇、乙腈購于美國Sigma公司；色譜級甲酸購于成都市科隆化學品有限公司；色譜級醋酸銨購于天津市科密歐化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。3 批八味小檗皮膠囊（國藥準字Z20025870，批號分別為20190502、20210617、20211125，規(guī)格0.3 g/粒）均購于青海久美藏藥藥業(yè)有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取各對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得各單一對照品母液。量取各單一對照品母液適量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，即得木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸、阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、綠原酸、沒食子酸、訶子鞣酸、柯里拉京、鞣花酸、甘草素、甘草苷、蘆丁、槲皮素、甘氨膽酸、膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、熊去氧膽酸質量濃度分別為110 000.00、91 000.00、110 437.50、8 150.00、2 700.00、21 093.75、9 720.00、18 000.00、3 019.50、61 000.00、11 900.00、3 180.00、61 500.00、56 700.00、9 900.00、21 200.00、900.90、2 484.00、487.50、342.00、5 340.00、3 040.00、300.00、3 030.00、318.00 ng/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取八味小檗皮膠囊內容物約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加入70%甲醇35 mL，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，待冷卻后，稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜與質譜條件

2.2.1 色譜條件 以WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫（0.01～1.00 min，10%B→45%B；1.00～3.00 min，45%B→70%B；3.00～4.00 min，70%B；4.00～5.00 min，70%B→75%B；5.00～7.00 min，75%B；7.00～10.00 min，75%B→95%B；10.00～20.00 min，95%B）；柱溫為25 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為5 μL。

2.2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正、負離子模式下選擇多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式測定各成分含量；毛細管電壓分別為4 000 V（+）、2 500 V（－）；干燥氣為氮氣，干燥氣流速為11 L/min，溫度為300 ℃，壓力為15 psi；碰撞氣為高純氮氣。詳細的質譜參數信息見表1。

表1 25種成分的質譜參數

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.1”項下各單一對照品母液及供試品溶液（批號20190502），以70%甲醇作為空白溶液，按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣，記錄色譜圖。結果顯示，空白溶液對所測成分無干擾，且供試品溶液中25種成分的出峰時間與對照品溶液中的基本一致，說明該方法專屬性較好。木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等8 種成分的MRM 色譜圖見圖1（其余成分的MRM色譜圖略去）。

圖1 木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等8種成分的MRM色譜圖

2.3.2 線性關系考察及定量限、檢測限測定 精密量取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，用甲醇稀釋成系列工作溶液。取上述系列工作溶液和混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。以峰高信號為基線噪音信號的10 倍測定定量限，以峰高信號為基線噪音信號的3倍測定檢測限。結果見表2。

表2 25 種成分的回歸方程、線性范圍、定量限、檢測限測定結果

2.3.3 精密度試驗 稱取八味小檗皮膠囊內容物（批號20190502），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜與質譜條件于同日內連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝6），說明儀器精密度較好。

2.3.4 重復性試驗 取八味小檗皮膠囊內容物（批號20190502），共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分含量的RSD均小于3.00%（n＝6），說明方法重復性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取八味小檗皮膠囊內容物（批號20190502），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h 后按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝7），說明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的八味小檗皮膠囊內容物（批號20190502），共6 份，每份約0.05 g，精密稱定，按已知含量的100%加入各單一對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，木蘭花堿、小檗堿、蟾蜍色胺、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等25 種成分的加樣回收率均在80%～115%之間，RSD均小于3.00%（n＝6），表明該方法準確可靠。

2.4 樣品含量測定

取3 批八味小檗皮膠囊內容物約0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，各批樣品平行制備3 份，按“2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果顯示，木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸、阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、綠原酸、沒食子酸、訶子鞣酸、柯里拉京、鞣花酸、甘草素、甘草苷、蘆丁、槲皮素、甘氨膽酸、膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、熊去氧膽酸的含量分別為16.94～20.82、3.78～5.17、9.11～11.43、0.24～0.30、0.20～0.39、0.74～1.16、0.79～0.89、3.26～3.35、0.48～0.66、11.96～13.35、2.30～3.12、0.19～0.21、6.07～8.83、10.42～10.48、1.43～1.64、4.17～4.76、0.14～0.15、0.46～0.52、0.04、0.01、0.59～0.63、0.20～0.23、0.02、0.15～0.16、0.01 mg/g。結果見表3。

表3 八味小檗皮膠囊中25 種成分的含量測定結果（n＝3）

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

目前，僅有文獻采用HPLC 法測定了八味小檗皮制劑中小檗堿和沒食子酸的含量[2－4]，但由于復方制劑的成分復雜，僅以1 個或2 個成分進行成分分析不具有代表性。本課題組前期曾嘗試采用HPLC 法同時測定八味小檗皮膠囊中的多種成分，但結果發(fā)現，大部分成分都難以得到有效分離，故本研究充分利用HPLC-QqQMS技術的方法學優(yōu)勢對多種成分進行同時測定。通過對正、負離子模式的探索發(fā)現，在正離子模式下，木蘭花堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、胡椒堿、甘草酸的響應值較高，而阿魏酸、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、柯里拉京、甘草素、甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸等其他17種成分在負離子模式下的響應值較高。在此基礎上，還對各成分的碎裂電壓和碰撞能量進行了優(yōu)化，最終確定了本研究采用的質譜參數。

3.2 色譜條件的考察

本課題組前期分別考察了CAPCELL PAK（4.6 mm×250 mm，5 μm）和WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，結果發(fā)現，以WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱時，各色譜峰的峰形、分離度均較好。同時考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液、甲醇-水（含0.1%甲酸和5 mmol/L醋酸銨）、乙腈-0.1%甲酸溶液5個流動相體系，結果發(fā)現，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相時，所得色譜峰的峰形較好、響應值較高。此外，還考察了不同柱溫（25、30、35 ℃），結果發(fā)現，在3種柱溫條件下，所得色譜峰的峰面積及峰形相差不大。綜合各因素，最終確定了本研究采用的色譜條件。

3.3 提取條件的考察

本課題組前期分別考察了冷浸、回流和超聲3 種提取方法，結果發(fā)現，超聲提取更加簡便、易行，且大部分成分的提取效率較高。此外，還考察了提取溶劑（20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、超聲時間（15、30、45、60 min）和提取溶劑用量（15、25、35、45 mL），根據含量測定結果綜合分析，最終確定了本研究采用的供試品溶液制備方法。

3.4 含量測定結果分析

根據3 批樣品的含量測定結果可知，八味小檗皮膠囊中木蘭花堿、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、小檗堿、訶子鞣酸等成分的含量較高，而槲皮素、熊去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸等成分的含量較低。

綜上所述，八味小檗皮膠囊含有多種藏藥材，化學成分復雜多樣，相互之間干擾較大，采用常規(guī)的HPLC法難以進行多成分的定量分析。本研究采用HPLCQqQ-MS技術首次測定了八味小檗皮膠囊中小檗堿、木蘭花堿、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、羥基紅花黃色素A、柯里拉京等25種成分的含量（建立了甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸等無紫外吸收的膽汁酸類成分的含量測定方法）。本研究建立的方法操作簡單、檢測限低、分析時間短、穩(wěn)定性好，可同時對八味小檗皮膠囊中多種有效成分進行含量測定。