GC-C-/-小鼠在DSS 誘導下腸道炎癥損傷的變化

梁桂麗 ，李燦美 ，邢成鋒 ，董運龍 ，王 娟 ，雷 梓 ，繆應雷 ，蘭丹鳳

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院消化內科，云南省消化系統疾病臨床醫學研究中心，云南 昆明 650032;2）大理白族自治州人民醫院腫瘤科，云南 大理 671000;3）昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科;4）病理科，云南 昆明 650032）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種主要累及結腸的慢性特發性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD） 的主要類型，以反復發作的腹痛、腹瀉和粘液膿血便為常見的臨床癥狀，可導致嚴重的并發癥，增加腸癌風險甚至威脅生命[1]。全世界將近500 萬人受IBD 困擾，既往IBD 在歐美國家多見，亞非國家少見，近些年來IBD 的發病率較前明顯升高，尤其在發展中國家[2]。盡管IBD 的發病機制尚未完全明確，多數學者認為它是由多種因素相互作用所致，與遺傳易感者在環境、精神因素作用和腸道菌群的參與下免疫應答失調有關[3]。近年來研究發現鳥苷酸環化酶C（guanylate cyclase C，GCC）信號轉導通路調節腸上皮屏障功能和腸道炎癥的發生。GC-C 是一種主要表達于腸上皮細胞的跨膜受體，其內源性配體是鳥苷蛋白（guanylin，Gn）和尿鳥苷素（uroguanylin，Ugn），亦表達于胃腸道上皮細胞[4]。當配體（Gn/Ugn）與GC-C 結合后，刺激細胞內三磷酸鳥苷（GTP）轉換為環磷酸鳥苷（cGMP），cGMP 水平增高可促進氯離子分泌，抑制鈉離子吸收，導致水和離子分泌至腸腔，參與維持細胞內外正常的離子濃度和腸道水電解質平衡[5]。

本課題前期研究發現，活化的GC-C 信號通路可保護腸上皮細胞與腸上皮內淋巴細胞的腸黏膜免疫屏障，GC-C 配體可能成為UC 潛在的治療靶點[6]。動物實驗研究發現，結腸炎小鼠在注射Gn 過表達慢病毒載體后精神、進食及活動好轉，腸道通透性降低，稀便、粘液血便和結腸組織炎癥明顯減輕，外周血炎癥相關因子水平顯著降低[7]。然 而，GC-C 基因敲除（GC-C-/-）小鼠在DSS 誘導下腸道炎癥反應的變化尚不清楚。因此，本研究運用GC-C-/-小鼠，探索其在化學物質作用下與野生型小鼠相比腸道炎癥損傷的差異，為尋求IBD 新的治療策略提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

6～8 周齡的GC-C 基因敲除（GC-C-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠，體重18～22g，雄性，在江蘇集萃藥康生物科技有限公司完成GC-C 基因敲除小鼠的構建和鑒定實驗（許可證號：SCXK（蘇）2018-0008，動物批號：GFW01202003804）。GCC-/-小鼠制作和鑒定策略見圖1。GC-C-/-小鼠構建：根據NCBI 編號選取轉錄本201（ENSMUST000 00032338.9）進行基因編輯。用CRISPR/Cas9 系統制作GC-C 基因敲除小鼠。把轉錄得到的sgRNA和cas9 混合并調整注射濃度，用顯微注射儀將其注射入Balb/c 小鼠受精卵中，將1-3 外顯子確定為切割位點，然后將受精卵移植到Balb/c 偽孕雌性小鼠的子宮內，等待F0 代出生。GC-C-/-小鼠鑒定：剪取尾組織，用酚氯仿法直接提取DNA，在靶區域內設計合成引物并鑒定，選取PCR 陽性樣品進行測序，引物購買自生工生物工程（上海）股份有限公司，鑒定凝膠電泳圖如圖2。右旋糖酐硫酸酯鈉（DSS），批號：S3045，貨號：160110，由MP Biomedicals 生物醫學公司生產。GCC（#HQP008552）引物由廣州復能公司（GeneCopoeia）合成。抗體rabbit polyclonal anti-GC-C（Abcam，貨號：ab225864），稀釋度：1∶1 000；通用二抗anti-rabbit IgG（CST，貨號：7074），稀釋度：1∶2 000。

圖1 GC-C 基因敲除小鼠制作和鑒定策略圖Fig.1 The production and identification strategy of GC-C knockout mice

圖2 GC-C 基因敲除小鼠鑒定電泳圖Fig.2 The identification electrophoretogram of GC-C knockout mice

1.2 實驗動物分組

將48 只小鼠隨機分組，12 只/組，共4 組。具體分組及實驗操作過程如下：（1）WT 小鼠對照組（Control）和GC-C-/-小鼠對照組（GC-C-/-）：均予以正常自由飲水、正常飼養；（2）WT 小鼠結腸炎組（WT+DSS）和GC-C-/-小鼠結腸炎組（GC-C-/-+DSS）：把DSS 混溶于蒸餾水并按配比調制成3%（W/V）的水溶液，小鼠每日自由飲用，共7 d，均不需另予飲水。本實驗已通過昆明醫科大學醫學倫理委員會審批。

1.3 疾病活動指數（DAI）評分

從實驗第 1 日起，每日稱量小鼠體重，觀察大便性狀如有無稀便，有無潛血（聯苯胺法測定）及肉眼血便并進行DAI 評分（評分標準見表1）[8]。DAI 評分=（體重評分+大便性狀評分+出血評分）/3。

表1 DAI 評分標準Tab.1 DAI scoring criteria

1.4 實驗組織取材

實驗第8 日，稱量小鼠體重并收集糞便樣本后，使用10%水合氯醛2 mL 腹腔內注射進行小鼠麻醉，在麻醉狀態下通過摘眼球法處死小鼠。收集小鼠外周血，常溫放置1 h，4 000 r/min 離心10 min 獲取血清。開腹后及時、準確地分離并測量小鼠結腸長度并觀察其糞便外觀、腸道大體形態特征以及有無粘連、狹窄等情況。游離并仔細截取小鼠全側結腸，在冰生理鹽水中沿腸系膜緣處縱行切開腸腔，使腸粘膜得以充分暴露，輕輕刮除腸腔內成型糞便并進行清洗。將剪切成長度1 cm 的多段結腸組織部分于4%多聚甲醛中固定，部分用于刮取以收集腸粘液，部分剝取腸粘膜并置于-80 ℃凍存。

1.5 結腸組織GC-C 表達的檢測

采用qRT-PCR 和Western blot 方法檢測小鼠腸粘膜組織GC-C 的表達。參照RNA Simple Total RNA kit 試劑盒（天根生物公司）使用說明書的實驗步驟，提取組織總RNA。使用Fermentas 逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA 并依照Fermentas SYBR Green 熒光定量檢測法試劑盒說明書上的步驟與要求進行熒光相對定量指標的檢測，采用2-ΔΔCt方法分析樣品GC-C mRNA 的相對表達量。此外，按照試劑盒產品使用技術指導與說明書的要求和方法步驟，快速進行組織總蛋白的提取與純化并準確的測定蛋白濃度。每孔加入等量蛋白進行電泳分離后均勻轉至硝基纖維素膜上，用牛血清白蛋白封閉，與稀釋的一抗孵育過夜，次日清晨再與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。最后再以β-actin 為內參計算目的條帶與β-actin 灰度比值。

1.6 結腸組織病理學評分

制備石蠟切片，將石蠟切片進行常規脫蠟、水化后，蒸餾水反復洗滌約5 min。經蘇木熒光素染色法染色16 min，自來水中反復洗沖以去蠟表面浮色。用1%濃度的稀鹽酸酒精水溶液（濃鹽酸1 mL 加入99 mL 的75%無水乙醇中配制）反復分化約2 s 后立即以自來水重復洗滌返藍。室溫下伊紅染色后沉淀15 s，自來水終止顯色并進行梯度酒精脫水各10 min。經對硝基二甲苯乙醇透明溶液沉淀30 min 干燥處理后再用中性樹膠封片，在普通的光學顯微鏡條件下進行觀察并記錄拍照。請病理科醫師使用普通光學顯微鏡觀察結腸組織的炎癥損傷情況，并進行組織學炎癥評分[8]，見表2。

表2 組織病理學評分標準Tab.2 Histopathological scoring criteria

1.7 外周血清和腸黏液中炎癥相關因子的檢測

運用ELISA 方法檢測外周血清和腸黏液中IL-8 和TNF-a 的水平。根據試劑使用和操作指導說明書上提供的實驗操作方法和步驟配制標準液并在標準品孔各加入不同濃度的50 μL 標準液，而各待測樣品孔則分別先后添加40 μL 標準樣本液和10 μL 的待測樣本液。除空白孔外，每孔加100 μL 酶標液后覆板貼置于37 ℃孵育1 h，隨即棄去余液并迅速甩干。每孔按照先后順序依次緩慢均勻滴加顯色劑A、B 各50 μL，輕輕震蕩混勻后置于37 ℃避光處顯色15 min，后每孔再加終止液50 μL 以保證完全終止顯色反應。以空白孔調零，在反應過程完全終止后15 min 內用酶標儀在450 nm 波長段依次測量出每個樣品的光密度（OD 值）。使用ELISAca1c 軟件進行計算和分析即可得到標準品濃度和OD 值之間的標準曲線并計算回歸方程，根據所求得的回歸方程即可算出待測樣本中IL-8 和TNF-α 的含量。

1.8 統計學處理

運用SPSS 17.0 軟件進行實驗數據的統計與分析。所有實驗均平行測定3 份，并至少重復3 次。計量資料以均數±標準差（±s）表示。2 組間均數比較用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析ANOVA 檢驗，兩兩比較用q檢驗。檢驗水準取值0.05（α=0.05），P＜ 0.05 提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠DAI 評分的比較

實驗對照組小鼠活動、反應、覓食及排便正常，體重增加，所有小鼠均存活。結腸炎組的部分小鼠從實驗第2 天開始出現腹瀉，始見少量黃色稀便，后逐漸加重，甚至可見黏液血便，期間小鼠有四肢懶動，喜扎堆，進食速度減慢、量少，體重下降。實驗結束時WT 小鼠結腸炎組死亡1 只，GC-C-/-小鼠結腸炎組死亡2 只。與對照組相比，結腸炎組DAI 評分均明顯升高（P＜ 0.05）。其中，GC-C-/-小鼠結腸炎組DAI 評分較WT 小鼠結腸炎組明顯升高（P＜ 0.05，圖3A）。通過小鼠結腸長度測量結果發現，與對照組相比，結腸炎組小鼠結腸長度明顯下降（P＜ 0.05）。GC-C-/-小鼠結腸炎組較WT 小鼠結腸炎組結腸長度亦明顯下降（P＜ 0.05，圖3B）。

2.2 結腸組織GC-C 的表達

運用實時熒光定量PCR 檢測發現，WT 小鼠結腸炎組腸粘膜組織GC-C mRNA 相對表達量WT 小鼠對照組顯著降低（P＜ 0.05），而GC-C-/-小鼠對照組和GC-C-/-小鼠結腸炎組腸粘膜組織均無GC-C 表達（圖3C）。Western blot 檢測結果與qRT-PCR 檢測結果一致（圖3D）。

圖3 各組小鼠DAI 評分、結腸長度和GC-C 表達的比較Fig.3 The comparison of DAI scores，colon length and GC-C expression of mice in each group

2.3 各組小鼠結腸大體形態和長度的比較

肉眼直接觀察上述對照組實驗小鼠的結腸外觀及腸粘膜組織大體結構形態，可見腹腔內組織器官結構的生理解剖位置及形態正常，腸與周圍組織臟器之間無黏連，腸粘膜光滑呈淡粉色，無增厚、糜爛、潰瘍等。WT 小鼠結腸炎組腹腔內腸與周圍組織臟器間輕度黏連，腸壁增厚，腸粘膜表面充血水腫，部分組織表面有淺表性糜爛，未見潰瘍。GC-C-/-小鼠結腸炎組較嚴重，腹腔內腸與周圍組織臟器間黏連明顯，病變腸段充血增厚，管腔狹小，漿膜面彌漫性充血水腫，腸粘膜表面見大量糜爛，部分腸粘膜可見明顯潰瘍，見圖4。

圖4 各組小鼠結腸大體形態的改變Fig.4 The changes of colonic general morphology in each group

2.4 結腸組織病理學評分

通過光學顯微鏡觀察可見，對照組實驗小鼠結腸組織中各層結構清晰，上皮細胞層的排列規則且整齊，杯狀細胞數量豐富且排列規整，腸腺規則，腺體結構未見異常，固有層可見毛細血管網和少量的散布在周圍的淋巴細胞。WT 小鼠結腸炎組腸粘膜層的部分組織結構缺失，杯狀細胞數量減少，僅存部分腺體結構，粘膜固有層可見炎癥細胞浸潤。GC-C-/-小鼠結腸炎組腸粘膜層出現大量組織缺失，杯狀細胞明顯減少，固有層內見大量的炎癥細胞浸潤，見圖5。通過對各組小鼠結腸組織病理學評分比較發現，GC-C-/-小鼠結腸炎組的組織病理學評分較WT 小鼠結腸炎組顯著升高（P＜ 0.05），見圖5E。

圖5 各組小鼠結腸組織HE 染色圖片（X10）和病理學評分的比較Fig.5 The comparison of HE staining picture（X10） and pathological score of colonic tissue in each group

2.5 各組小鼠外周血清和腸黏液中炎癥因子水平的比較

運用ELISA 方法檢測各組小鼠外周血清和腸黏液中IL-8 和TNF-α 的水平。研究結果顯示，與對照組相比，結腸炎組小鼠外周血清IL-8 和血TNF-α 水平均明顯增高（P＜ 0.05）。其中，GCC-/-小鼠結腸炎組較WT 小鼠結腸炎組血清IL-8（圖6A）和TNF-α（圖6B）的表達水平亦明顯增高（P＜ 0.05）。各組小鼠腸黏液中IL-8（圖6C）和TNF-α（圖6D）水平的變化與外周血清一致。

圖6 各組小鼠外周血和腸黏液IL-8、TNF-α 水平的比較Fig.6 The comparison of IL-8 and TNF-ɑ in the peripheral blood and intestinal mucus of mice in each group

3 討論

IBD 由于病程長、復發率高，可引起多種臨床表現和并發癥，其治療仍面臨著巨大的挑戰。常見的IBD 治療藥物包括5-氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑、抗TNF-α 和抗整合素等生物制劑、抗生素等[9]。但這些藥物對部分患者療效仍欠佳，可能導致患者出現嚴重的副作用，甚至需要行結腸切除手術，嚴重影響了患者的生活質量。隨著一系列基礎研究的開展，出現了許多新的IBD 治療方法，包括干細胞移植、糞菌移植和某些特殊的飲食治療等[10-11]。然而，糞菌移植在成人IBD 患者中療效有限，接受度差，干細胞移植目前也面臨很多技術和倫理問題。近年來研究發現，GC-C 信號通路參與保護腸粘膜屏障，具有抗炎、促分化、抑制腸上皮細胞增殖和腫瘤發生、減輕內臟痛覺、維持腸道內穩態等作用[12]。內源性肽Gn/Ugn 通過激活腸上皮細胞頂端表達的GC-C 而發揮作用，Gn/Ugn 與GC-C 結合后可提高細胞內cGMP 水平，然后通過一系列下游的的信號反應使液體分泌至腸腔，GC-C 的內源性配體發揮“流動性感受器”的作用，維持腸道內水電解質平衡及腸黏膜最佳的水合作用[4]。

本研究發現，與野生型（WT）小鼠相比，GCC-/-小鼠在DSS 作用下DAI 評分、結腸組織病理學評分、外周血和腸粘液中炎癥因子IL-8 和TNFα 水平均明顯升高，表明GC-C-/-小鼠在化學物質誘導下腸道炎癥性損傷更嚴重。結合本課題前期的研究發現，UC 患者腸黏膜組織中GC-C、Gn、Ugn 的表達下調，并與患者的疾病活動度呈負相關[13]。經轉染GC-C shRNA 干擾載體的Caco-2細胞在IL-1β 的刺激下，單層細胞的通透性、炎癥因子IL-8 和TNF-α 的水平升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、腸上皮細胞間緊密連接蛋白claudin-1 和ZO-1 的水平下降更為明顯[14]。經注射Gn 過表達慢病毒載體的結腸炎小鼠腸道通透性降低，結腸組織炎癥損傷亦明顯減輕[7]。以上均提示GC-C 信號通路可能在腸道炎癥的發生發展中起保護性作用。與本研究結果一致，Harml-Laws E 等[15]研究發現，與GCC+/+小鼠相比，經腹腔內注射LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）后GC-C-/-小鼠結腸組織的促炎基因表達增加，自發性結腸炎病情加重，提示GC-C 缺乏可能導致嚴重的腸道炎癥反應。然而，關于GC-C 在腸道炎癥免疫失調中的作用及機制研究尚存在一定的爭議。Fiskerstrand T 等[16]研究報道GC-C 信號的增加可能擾亂了正常的腸粘膜功能，進一步促進腸道炎癥的發生。因此，GCC 信號通路可能在腸道炎癥的發生過程中發揮不同的作用，只有在生理水平上的配體激活GC-C才能發揮腸粘膜保護作用，GC-C 信號通路的失活和過度激活都會破壞腸粘膜的內穩態，導致一系列腸道疾病如IBD 的易感性[17]。

IBD 的發病與腸粘膜屏障功能受到破壞密切相關，GC-C 信號通路可通過保護腸黏膜屏障而維持腸道內穩態[4]。既往的研究報道，IBD 炎癥早期GC-C 信號通路失調可導致腸粘膜屏障功能受損，可能會加速疾病的進展[18]。腸粘膜屏障由腸上皮細胞間的緊密連接蛋白作用于腸上皮形成，調節腸粘膜的通透性并調控粘膜下層及以下的通路。既往研究發現GC-C 可通過調節AKT 依賴的腸上皮屏障完整性而保護腸粘膜，對抗結腸炎和結腸腫瘤的發生[19]。Han X 等[20]研究發現GC-C-/-小鼠和Ugn-/-小鼠的腸道通透性較野生型小鼠高，GC-C-/-小鼠腸上皮細胞間緊密連接蛋白的表達降低，易發生LPS 誘導的腸道炎癥損傷，而激活GC-C 后腸上皮通透性降低，緊密連接蛋白的表達上調。此外，Li P 等[21]研究發現GC-C 信號通路失活可引起腸杯狀細胞數量減少，導致腸道表面的黏液蛋白和三葉因子分泌減少，而黏液蛋白和三葉因子是腸上皮屏障的重要成分。

綜上所述，本研究表明GC-C 基因敲除小鼠在化學物質誘導下腸道炎癥性損傷加重，進一步支持GC-C 信號通路在腸道炎癥損傷和腸上皮屏障功能中可能發揮保護性作用，GC-C 信號通路可能參與了UC 的發生與發展。然而，GC-C 信號通路的過度激活可導致過多的水分進入腸腔而發生腹瀉，未來仍需進一步研究探索GC-C 在IBD等腸道疾病中的作用及機制。