CircRNA EZH2 通過調控miR-30c-5p 促進前列腺癌細胞增殖和遷移

趙 斌 ，段元鵬 ，張國穎 ，畢城偉 ，楊李波 ，施致裕 ，楊 勇 ，張建朋 ，高 婷

（1）云南省腫瘤醫院泌尿外科，云南 昆明 650118;2）云南財經大學校醫院，云南 昆明 650021）

前列腺癌是全球男性中最常見的癌癥之一[1]，轉移性前列腺癌的5 a 生存率僅為31%，且復發及晚期前列腺癌通常被認為是無法治愈的[2]。在世界較發達地區，前列腺癌的發病率最高[3]，相比之下，亞洲男性的發病率低于全球水平，但前列腺癌仍然是影響男性健康的一個重大醫學問題。因此，闡明前列腺癌的基因機制，尋找新的診斷和治療的生物標志物至關重要。

CircRNA 是一類內源性非編碼RNA，源自前體mRNA 反向剪接，其通過3' 和5' 端反向剪接形成共價閉合結構。近年來，在各種生物體中已鑒定出數以千計的circRNA，并發現他們在許多疾病中發揮著關鍵作用，尤其是癌癥，circRNA可以參與癌證的諸多病理生理過程，包括細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡[4-6]。然而，目前有關circRNA 在前列腺癌中的報道較少。Wen 等[7]發現circRNA EZH2 與膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲相關。但circRNA EZH2 在前列腺癌中的作用和機制尚不清楚。

微小RNA（miRNA）是一類長度約22 個核苷酸的非編碼小RNA，在調節細胞周期、細胞增殖和凋亡以及腫瘤發展中起著關鍵作用。MiR-30c-5p 是多種惡性腫瘤進展的關鍵調控基因，在非小細胞肺癌[8]、大腸癌[9]、胰腺癌[10]等疾病中均有報道。CircRNA 和miRNA 的相互作用在癌癥發生和發展中起重要作用。本研究旨在為解釋circRNA EZH2 調控miR-30c-5p 在前列腺癌中的作用機制提供理論依據，同時將為前列腺癌的診斷和治療提供新的生物標志物和靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人前列腺癌細胞系LNCaP（貨號CL-0143）、人正常前列腺上皮細胞RWPE1（貨號CL-0200）、人胚腎細胞HEK-293（貨號CL-0001）購自武漢Procell 公司；RPMI1640 培養基、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購自上海東仁化學公司，劃痕插件購自德國IBIDI 公司；riboFECT? CP 轉染試劑購自廣州銳博生物公司；circRNA EZH2 的siRNA（si-circRNA EZH2）、siRNA 陰性對照（si-NC）、miR-30c-5p inhibitors 序列由廣州銳博生物公司合成；Trizol 試劑盒購自美國 Life technologies 公司，FastKing RT Kit （With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京天根公司，ECL 顯影液購自美國Millipore 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液均購自碧云天；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、JAK1、PI3K 抗體購自英國abcam 公司；GAPDH 抗體、HRP 標記的IgG二抗購自美國CST 公司。熒光素酶載體購自上海海吉浩格生物科技有限公司；Lipofectamine?3000、購自美國Thermo 公司；RNase R 購自廣州吉賽公司。

1.2 生物信息學分析

在癌癥基因組圖譜（TCGA）[11]數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中獲取數據對前列腺癌旁和腫瘤組織中的circRNA EZH2 表達差異進行分析，中位數作為閾值區分高低表達。用Kaplan-Meier曲線檢測circRNA EZH2 與前列腺癌進展的時間相關性，起點事件為手術切除；終點事件為死亡；刪失數據為失訪、死于其他疾病、觀察結束時病人尚存活。Logrank 法檢驗及單因素預后分析，Cox 風險比例模型多因素預后分析。用starBase v2.0 篩選下游靶基因。

1.3 細胞培養及轉染

用含10% FBS、1%雙抗和1%谷氨酰胺的RPMI 1640 培養基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養LNCaP 細胞。待細胞匯合度達80%時，將細胞接種至6 孔培養板，每孔接種5×104個細胞，過夜培養。細胞分為：對照組、陰性對照組、si-circRNA EZH2 組、si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p inhibitors 聯合應用組。參照riboFECT?CP 轉染試劑說明書進行轉染。轉染前，對照組更換為無雙抗的RPMI 1640 培養基；陰性對照組更換為含si-NC（50 nM）的RPMI 1640 培養基；sicircRNA EZH2 組更換為含si-circRNA EZH2（50 nM）的RPMI 1640 培養基；si-circRNA EZH2和miR-30c-5p inhibitors 聯合應用組更換為含sicircRNA EZH2（50 nM）和miR-30c-5p inhibitors的RPMI 1640 培養基，繼續培養48 h。

1.4 CCK-8 法檢測細胞增殖能力

接種LNCaP 細胞至96 孔板內，另接種3 孔LNCaP 細胞正常培養作為CCK-8 對照組，每孔接種2 500 個細胞，每組3 個孔重復。RPMI1640培養基繼續培養48 h 后，每孔加入10 μLCCK-8試劑，在培養箱內孵育2 h 后，于酶標儀450 nm波長下檢測吸光度。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

接種LNCaP 細胞至IBIDI 插件內，每孔接種5×104個細胞，使用RPMI 1640 培養基在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。待匯合度達80%時，移除劃痕插件，于0 h 和24 h 時間點觀察劃痕寬度，在倒置顯微鏡下拍攝記錄。

1.6 RT-qPCR 檢測細胞中相關 circRNA、miRNA 及JAK1 的mRNA 表達水平

按照TRIZOL 法提取LNCaP 細胞中的總RNA，測量RNA 濃度后，逆轉錄合成cDNA 第一條鏈。根據qPCR 試劑盒說明書對cDNA 進行擴增。引物序列見表1。反應體系為10 μL，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共進行45個循環。以GAPDH 作為circRNA EZH2 和JAK1的內參，以U6 作為miR-30c-5p 的內參，運用2-ΔΔCt法進行定量分析。

表1 RT-qPCR 所需引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 Western blot 實驗檢測細胞中JAK1 和PI3K 的表達水平

JAK1 信號在癌癥中常被激活[12]，于是筆者檢測了circRNA EZH2 對其是否有調控。加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，從LNCaP 細胞中提取總蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行定量。樣品中的蛋白采用SDS-PAGE 分離并濕轉移至PVDF 膜上，BSA 封閉后加入JAK1（1∶1 000）和PI3K（1∶1 000）一抗，在4 ℃下孵育過夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，使用ECL 顯影液曝光。使用Image J 軟件測定灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

將circRNA EZH2 的野生型（WT）或突變型（MUT）3’-UTR 克隆到pGL3 啟動子熒光素酶載體。按照制造商說明，使用Lipofectamine?3000用miR-30c-5p mimic 和circRNA EZH2 或其突變體轉染HEK-293 細胞。48 h 后通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9 RNase R 處理

總RNA（2 μg）在37 ℃下與3 U/mg RNase R共同孵育15 min。qRT-PCR 檢測circRNA EZH2的表達。

1.10 統計學處理

通過 Graph-Pad Prism 9 軟件（GraphPad Software，San Diego，CA） 進行 Kolmogorov-Smirnov 檢驗數據的正態性。正態分布的連續性變量均以平均數±標準差（mean±SD）表示，并通過Graph-Pad Prism 9 軟件進行統計分析。組間比較采用單因素方差分析，如有差異進一步用Tukey's 檢測兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circRNA EZH2 在前列腺癌中高表達

首先通過TCGA 數據庫評估了circRNA EZH2 在499 例前列腺癌腫瘤樣本和52 例癌旁組織中的表達，腫瘤樣本中位數為2.504，癌旁組織中位數為1.483，發現circRNA EZH2 在前列腺癌組織中顯著高表達（P＜ 0.01，圖1A）。此外，對TCGA 數據庫中的前列腺癌樣本進行Kaplan-Meier 分析結果顯示，前列腺癌患者中，circRNA EZH2 表達水平較高的患者（250 例）相較于circRNA EZH2 表達水平較低的患者（249 例）生存率更低（圖1B）。RT-qPCR 結果顯示，circRNA EZH2 在前列腺癌LNCaP 細胞中的表達較人前列腺上皮細胞RWPE1 中更高（P＜ 0.001，圖1C）。這些數據表明circRNA EZH2 在前列腺中過表達，并且circRNA EZH2 高表達與前列腺癌的進展和不良預后相關。

圖1 CircRNA EZH2 在前列腺癌中高表達Fig.1 circRNA EZH2 in prostate cancer

2.2 CircRNA EZH2 環狀結構的驗證

通過RNase R 酶切實驗，證實了circRNA EZH2 具有高度保守的環狀結構，結果顯示，線性EZH2 被RNase R 酶切，而circRNA EZH2 沒有被酶切（P＜ 0.001），見圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測LNCaP 細胞總RNA 經RNase R處理后circRNA EZH2 及線性EZH2 的表達Fig.2 qRT-PCR detected the expression of circRNA EZH2 and linear EZH2 after RNase treatment total RNA from LNCaP cells

2.3 敲降circRNA EZH2 抑制前列腺癌細胞增殖和遷移

在LNCaP 細胞中通過轉染si-circRNA EZH2成功下調circRNA EZH2 的表達，且轉染si-NC未改變circRNA EZH2 的表達（P＜ 0.000 1，圖3A）。CCK-8 檢測表明，轉染si-circRNA EZH2 可抑制LNCaP 細胞的增殖（P＜ 0.000 1，圖3B），使其生長密度降低（圖3D）。此外，劃痕實驗表明，轉染si-circRNA EZH2 后，LNCaP 細胞的遷移明顯減弱（P＜ 0.000 1，圖3C、3E）。以上數據表明，circRNA EZH2 促進LNCaP 細胞的增殖和遷移。

圖3 CircRNA EZH2 對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響Fig.3 The effects of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells

2.4 circRNA EZH2 靶向調控miR-30c-5p

通過CircBase、StarBase 等數據庫進行預測發現circRNA EZH2 具有hsa-miR-30c-5p 結合位點，推測circRNA EZH2 可能與miR-30c-5p 有相互作用（圖4A）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-30c-5p 顯著降低了WT-circRNA EZH2 的熒光素酶活性（P＜ 0.000 1，圖4B）。通過RT-qPCR實驗對miR-30c-5p 抑制劑效果進行驗證，結果顯示與對照組和過表達組相比，miR-30c-5p 抑制劑顯著降低了miR-30c-5p 的表達（P＜ 0.001，圖4C）。RT-qPCR 實驗顯示，在轉染si-circRNA EZH2 的LNCaP 細胞中miR-30c-5p 表達顯著上調，轉染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制劑后，miR-30c-5p 的表達與僅轉染si-circRNA EZH2 組相比明顯降低（P＜0.000 1，圖4D）。而circRNA EZH2 的表達受miR-30c-5p 抑制劑影響不明顯（P＜ 0.000 1，圖4E），猜測miR-30c-5p 可能是circRNA EZH2 的下游靶基因。

圖4 CircRNA EZH2 靶向miR-30c-5pFig.4 CircRNA EZH2 targeted miR-30c-5p

2.5 circRNA EZH2/miR-30c-5p 軸調控前列腺癌細胞增殖和遷移

CCK-8（P＜ 0.000 1，圖5A）和細胞培養顯微鏡觀察（圖5B）顯示，miR-30c-5p 抑制劑的加入下調了轉染si-circRNA EZH2 對LNCaP 細胞增殖的抑制，且細胞增殖能力恢復至較control 組和si-NC 組無顯著差異。此外，LNCaP 細胞的遷移能力也在抑制miR-30c-5p后恢復（P＜ 0.000 1，圖5C、5D）。上述實驗結果說明circRNA EZH2可以通過調控miR-30c-5p 的表達來調控LNCaP細胞增殖和遷移。

圖5 CircRNA EZH2 調控miR-30c-5p 軸對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響Fig.5 CircRNA EZH2 regulated cell proliferation and migration via miR-30c-5p in prostate cancer cell

2.6 circRNA EZH2 調控JAK1 和PI3K 信號通路

RT-qPCR 結果顯示（P＜ 0.000 1，圖6A），sicircRNA EZH2 的轉染使JAK1 的表達顯著下調，而si-circRNA EZH2 轉染后加入miR-30c-5p 抑制劑使JAK1 的表達相較于僅轉染si-circRNA EZH2 組顯著上調，Western blot 實驗也得到同樣的結果（P＜ 0.000 1，圖6B、6C）。Western blot 結果顯示，轉染si-circRNA EZH2 后PI3K 的表達下調，而同時轉染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制劑后PI3K 的表達水平高于僅轉染sicircRNA EZH2 組（P＜ 0.005，圖6B、6D）。這表明PI3K 信號與circRNA EZH2 的高表達正相關，且受miR-30c-5p 的負調控。

圖6 CircRNA EZH2 對JAK1 和PI3K 的調控Fig.6 CircRNA EZH2 regulated JAK1 and PI3K

3 討論

CircRNA 豐富而保守，而且與大多數其他線性RNA 相比，circRNA 更加穩定，因此circRNA可作為有效的生物標志物和治療靶點。目前關于circRNA EZH2 的研究較少，在已有報道中，circRNA EZH2 能通過NF-κB 通路調節豬腸上皮細胞的炎癥反應[13]；circRNA EZH2 在膠質瘤中可作為miR-1 265 的海綿調控DDAH1 和CBX3 的表達[14]。因此，circRNA EZH2 的失調可能在調節人類癌癥的進展中起重要作用。本研究中，筆者發現circRNA EZH2 在前列腺癌組織中高表達，并證明circRNA EZH2 在前列腺癌細胞中過表達且與癌癥發展相關。Kaplan-Meier 分析表明，circRNA EZH2 過表達與前列腺癌患者的生存率降低顯著相關。功能缺失實驗表明，circRNA EZH2在前列腺癌細胞中促進其增殖和遷移。在機制上，circRNA EZH2 通過調控miR-30c-5p 來調控JAK1 的表達并激活PI3K 信號通路。這些發現為了解circRNA EZH2 在前列腺癌進展中的致癌作用提供了見解，并表明circRNA EZH2 可能是前列腺癌預后和治療的生物標志物。

已經證明，circRNA 可以和miRNA 相互作用，以發揮生物學功能。筆者的結果證明，circRNA EZH2 能夠調控miR-30c-5p 的表達，進而調控下游基因JAK1 的表達，促進前列腺癌生長。JAK1是Janus 激酶家族成員之一，在多種類型的細胞中表達。它在許多腫瘤，包括前列腺癌的發展中有重要作用，并在轉移性癌癥進展中起關鍵作用[12]。在筆者的實驗中，沉默circRNA EZH2 能下調JAK1的mRNA 和蛋白表達，這表明circRNA EZH2 可能作為一種JAK1 抑制劑在前列腺癌的治療中發揮作用。

本研究本研究的另一個重要發現是circRNA EZH2 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號。PI3K 的信號傳導與人類腫瘤進展、腫瘤微血管密度增加以及癌細胞的趨化性和侵襲潛力顯著相關，PI3K 的突變在常見的人類癌癥中經常發生[15]，被認為是癌癥治療的關鍵靶點之一。筆者推測circRNA EZH2 在前列腺癌中的調控作用可能與PI3K 信號有關，并在LNCaP 細胞中檢測了circRNA EZH2 是否對PI3K 信號有影響。PI3K 信號通路在許多癌癥的發展中起著關鍵作用，在前列腺癌中也經常被異常激活，尤其是在轉移性前列腺癌中[16]。PI3K 信號的過度激活促進了前列腺癌的增殖，轉移和復發。例如，miR-133a-3p 下調激活的PI3K 信號能促進前列腺癌骨轉移[17]。雄激素剝奪療法是治療前列腺癌的一種主要方法，然而，大多數患者會對雄激素剝奪產生抵抗力，從而導致腫瘤持續生長，患者死亡率上升[18]。PI3K 信號通路的激活能夠重新連接雄激素受體的信號傳導，從而減少腫瘤對雄激素的需求，以促進前列腺癌生長[19]。筆者發現circRNA EZH2 的抑制下調了PI3K 信號的表達，相反的是，miR-30c-5p 的抑制激活了PI3K 信號。這些結果闡明了circRNA EZH2 可作為PI3K 通路的調節劑，并可作為干預前列腺癌的潛在靶標。

總而言之，本研究發現circRNA EZH2 在前列腺癌組織中上調，并有助于前列腺癌進展。circRNA EZH2 的缺失可影響miR-30c-p 的功能，下調JAK1 表達并干擾PI3K 信號通路，從而抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移。綜上，circRNA EZH2 可能作為前列腺癌過程中的致癌基因，為前列腺癌的診斷和治療提供潛在靶標。