趨化因子CXCL10 作為肝硬化生物標志物的意義

李思琪，邰文琳

（昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650101）

肝纖維化是各種慢性肝病（包括毒性損傷、病毒感染、自身免疫性疾病、代謝相關脂肪性肝病和遺傳性疾病、酒精性肝病）進展過程中的動態病理過程，是肝臟對慢性損傷的病理性修復反應。肝纖維化的特征是細胞外基質（extracellular matrix，ECM 即膠原、糖蛋白和蛋白多糖等）的過度積累，其被認為是一個中間階段，可以逆轉或進展為肝硬化和終末期肝病[1]。肝硬化是全球第11 大最常見的死亡原因，每年導致超過116 萬人死亡[2]。肝纖維化不僅增加了終末期肝病的發病率和死亡率，而且還增加了肝外疾病的風險，如非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝纖維化的病因之一，它增加了兒童和年輕人的心臟代謝死亡率[3]。新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，COVID-19）流行目前是全球存在的一個重要健康問題，肝纖維化是新冠肺炎患者不利結局的獨立危險因素[4]。然而，迄今為止，尚無有效的藥物被批準用于臨床預防肝纖維化的進展。因此，在肝纖維化的研究中，仍需進一步闡明肝纖維化的發病機制，探索新的有效治療方法。

趨化因子（Chemotactic cytokines）是一種小的分泌蛋白，可以將免疫細胞和非免疫細胞招募到炎癥或損傷部位。趨化因子在在肝臟中調節細胞傷口愈合反應起著重要作用，包括從循環和骨髓中招募炎癥細胞，以及駐留的肝細胞向損傷部位遷移。在本文中，筆者將重點研究趨化因子C-XC 基序趨化因子10（CXCL10，也稱為IP-10），CXCL10 由免疫細胞（單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）和非免疫細胞（內皮細胞、成纖維細胞、間充質細胞、星形膠質細胞和肝細胞）分泌[5-6]。在肝臟內，CXCL10 主要由肝纖維化的關鍵細胞如肝細胞、肝竇內皮細胞、肝星狀細胞表達[7]。CXCL10 的獨特受體是CXCR3，它是一種跨膜G蛋白偶聯受體，在效應T 細胞上高度表達。CXCL10 在感染性疾病、自身免疫性疾病和代謝性疾病中作為炎癥介質發揮關鍵作用，CXCL10還能誘導細胞凋亡和細胞遷移，調節細胞增殖和血管生成[8]。目前它已被證明會加重由ConA 引起的乙型肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝炎和T細胞性肝炎等肝病患者的肝臟炎癥狀況[9-10]。炎癥由氧化應激和促炎趨化因子和細胞因子引起，從而導致肝損傷并促進纖維化[11]。有研究發現血清和肝臟CXCL10 水平升高均與肝臟活組織檢查中的高活動度和纖維化嚴重程度相關[11]。CXCL10 在化學誘導的肝纖維化中發揮重要作用，CXCL10 可能會吸引肝星狀細胞到受損部位，參與肝細胞和免疫細胞之間的相互作用。CXCL10通過放大其他促炎細胞因子的作用來持續激活肝星狀細胞，包括TNF-α、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、干擾素（IFN-γ）和toll 樣受體9（TLR9）。這些數據表明，CXCL10 在肝炎中作為一種促纖維化因子，而CXCL10 的阻斷可能是肝纖維化的治療靶點。

肝纖維化早期診斷具有重要的臨床意義，肝活檢是診斷和分期的金標準。然而肝活檢存在一些缺點，如盲穿刺或肝病變不均勻造成的誤差。此外，肝穿刺是一種不能動態觀察的有創檢查。因此，它可能不被大多數患者所接受[12]。血清學診斷是應用最廣泛的無創診斷方法，其樣本采集方便，可動態觀察，但其特異性相對較低[13]，很少有參數可以被認為與纖維發生直接相關。目前，有幾種無創或微創的方法，如瞬時彈性掃碼（TE）和磁共振彈性成像用于肝纖維化分期[14]，它們可以為纖維化患者提供高精度、無創的肝臟硬度測量方法，但受到肥胖等多種因素的限制，或受炎癥活動的影響[15]。傳統的CT 圖像和MRI 可以對肝硬化和門脈高壓進行定量評價，但對早期肝纖維化無法進行定量評價。本文研究了CXCL10 可否作為一種無創標志物，以避免肝活檢引起的并發癥，可以動態監測肝功能變化，這可能有助于識別有進行性纖維化風險的患者，以便進行早期干預或保持更密切的監測，延緩肝硬化進展，降低肝癌發病率，通過血清學檢測來協助臨床診斷和治療。或者需要結合其他多種肝纖維化生物標志物進行分析，以提高特異性。

本研究的目的是闡明CXCL10 作為肝纖維化診斷和進展的無創生物標志物的潛力。在肝纖維化炎癥的多個信號通路中阻斷CXCL10 信號通路，有助于開發新的抗纖維化策略為肝纖維化的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

收集2021 年3 月至8 月期間昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科肝硬化EDTA-K2 抗凝管外周血標本64 管為實驗組，并收集同期體檢中心的健康人群的外周血標本64 管作為對照組。嚴格記錄患者的基本信息和實驗室檢查結果，以便進行統計分析。肝硬化組排除標準：（1）失代償期肝硬化；（2）原發性肝癌或其他惡性腫瘤；（3）合并其他重要臟器嚴重疾病、嚴重神經及精神疾病患者。該研究得到了昆明醫科大學第二附屬醫院倫理委員會的認證。

1.2 ELISA 檢測血漿中CXCL10 的濃度

血漿和上清中C-X-C 基序趨化因子10（CXCL10）的水平采用ELISA 試劑盒（Sino Biological Inc.）根據試劑盒的方案檢測。用酶標儀（BioTek，cytationl，美國）在450 nm 處讀取吸光強度。用標準物的濃度和OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式為y=81.672X2-77.543X+35.031，R2=0.989 4。將樣品的OD 值代入方程式，即可計算出CXCL10 濃度。將肝硬化患者血漿CXCL10水平分為低表達組（≤中位數水平）和高表達組（＞ 中位數水平），比較2 組的肝功指標和凝血五項有無差異。

1.3 肝功實驗結果

采用TBA-120FR 全自動生化分析儀檢測，凝血實驗結果用CS-5100 全自動血凝分析儀檢測。

1.4 統計學處理

應用SPSS 25.0 軟件和GraphPad Prism 8 對相關數據進行處理和分析。計量資料首先進行正態性檢驗，數據為正態分布時用均數土標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性分析用Pearson相關；數據呈非正態分布時，用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析用Spearman秩相關。進一步采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析CXCL10 的診斷效能。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝硬化患者一般臨床資料

收集肝硬化患者的年齡、性別和檢驗結果等臨床資料，經正態性檢驗分析，PT 和APTT 數據總體符合正態性分布，ALT、AST、LPS、GGT、TBA、TBIL、DBIL、IBIL、TT、FIB、DD 數據總體不符合正態分布，見表1。

表1 肝硬化患者的臨床資料[±s/M（P25，P75）]Tab.1 Clinical data of patients with cirrhosis[±s/M（P25，P75）]

表1 肝硬化患者的臨床資料[±s/M（P25，P75）]Tab.1 Clinical data of patients with cirrhosis[±s/M（P25，P75）]

2.2 2 組外周血中CXCL10 濃度比較

結果顯示，健康對照組（n=64）CXCL10 的濃度是20.94 ng/mL（16.96，27.78），肝硬化組（n=64）CXCL10 的濃度是81.07 ng/mL（28.09，196.17），P＜ 0.000 1，肝硬化患者血漿中CXCL10 水平顯著升高，2 組差異有統計學意義，見圖1。

圖1 肝硬化患者外周血中CXCL10 的表達Fig.1 Expression of CXCL10 in peripheral blood of patients with cirrhosis****P ＜ 0.000 1。

2.3 肝硬化患者肝功檢驗結果與CXCL10 濃度相關性分析

Spearman 秩相關分析結果顯示：肝硬化患者血漿中CXCL10 濃度與ALT 和AST 成正相關關系，P＜ 0.05，與其余生化指標之間未見相關性，見表2，圖2。

圖2 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與ALT、AST 關系Fig.2 The relationship between PLASMA CXCL10 concentration and ALT and AST in patients with cirrhosis

表2 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與肝功生化指標關系Tab.2 Relationship between plasma CXCL10 concentration and liver function biochemical indexes in patients with cirrhosis

2.4 肝硬化患者凝血功能檢驗結果與CXCL10 濃度相關性分析

Pearson 相關分析和Spearman 秩相關分析結果顯示：肝硬化患者血漿中CXCL10 濃度與PT、APTT、DD成正相關關系（P＜ 0.05），與TT 和FIB 之間未見相關性（P＞ 0.05），見表3，圖3。

圖3 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與PT、APTT、DD 關系Fig.3 Relationship between plasma CXCL10 concentration and PT，APTT and DD in patients with cirrhosis

表3 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與凝血指標關系Tab.3 Relationship between plasma CXCL10 concentration and coagulation indexes in patients with cirrhosis

2.5 CXCL10 相關影響因素的線性回歸分析

以 ALT、AST、LPS、GGT、TBA、TBIL、DBIL、IBIL、PT、APTT、TT、FIB、DD 為自變量，CXCL10 為因變量，多重線性回歸分析結果顯示，DD 的標準偏回歸系數為1.922，P＜ 0.05，可認為DD 對CXCL10 的影響最大，見表4。

表4 CXCL10 相關影響因素的線性回歸分析Tab.4 Linear regression analysis of CXCL10 related influencing factors

2.6 高表達CXCL10 組和低表達CXCL10 組實驗室指標差異分析

統計結果顯示，2 組ALT、AST、PT、APTT、DD 指標差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表5。高表達CXCL10 組中的ALT、AST、PT、APTT、DD 值均大于低表達CXCL10 組，見圖4。

圖4 高表達CXCL10 組和低表達CXCL10 組ALT、AST、PT、APTT、DD 比較Fig.4 Comparison of ALT，AST，PT，APTT and DD between the high-expression CXCL10 group and the low-expression CXCL10 group

表5 高表達CXCL10 組和低表達CXCL10 組實驗室指標差異分析[±s/M（P25，P75）]Tab.5 Difference analysis of laboratory indicators between high and low expression groups of CXCL10 [±s/M（P25，P75）]

表5 高表達CXCL10 組和低表達CXCL10 組實驗室指標差異分析[±s/M（P25，P75）]Tab.5 Difference analysis of laboratory indicators between high and low expression groups of CXCL10 [±s/M（P25，P75）]

*P ＜ 0.05。

2.7 血漿CXCL10 水平對肝硬化的診斷價值

以AUC 大于0.70 作為判斷該指標是否具有診斷價值的判斷標準。CXCL10 在預測肝硬化時，ROC 曲線下面積為0.826 4，大于0.7，約登指數為0.625，靈敏度值為0.833 3，特異度值為0.791 7，P＜ 0.000 1，具有較好的診斷效能，見圖5。

圖5 肝纖維化診斷的受試者工作特征曲線分析Fig.5 Analysis of operating characteristic curves of subjects in liver fibrosis diagnosis

3 討論

我國約有3 億肝病患者，包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝和酒精性肝病。每年有近40 萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總人數的51%[16]。由于肝病加重了我國的社會和醫療負擔，因此動態監測肝功能變化，延緩肝硬化進展，降低肝癌發病率，并通過血清學檢測協助臨床診斷和治療十分重要[17]。肝纖維化與肝細胞癌的發展密切相關，準確的纖維化評估對于肝細胞癌的篩查至關重要。區分晚期疾病患者，特別是肝硬化患者與輕度或無纖維化患者對于臨床治療決策很重要。目前，肝活檢組織病理學檢查仍是肝纖維化診斷的“金標準”。由于肝活檢屬于創傷性檢查，少數病例可能會發生并發癥，如疼痛、出血、感染甚至死亡，不易被患者接受和費用較高等缺點，限制了其普遍應用。盡管在東亞人群中已發現了一些與肝纖維化相關的重要生物標志物，如牛磺膽酸、紊亂的腸道微生物和糞便中的毛螺菌科[18-19]，但還需要確定更多的標記物，以促進肝纖維化檢測和預后預測的敏感性和特異性。除肝纖維化分期的病理檢查外，白蛋白、IV 型膠原蛋白、羥脯氨酸（Hyp）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、轉氨酶（ALT）、血紅蛋白、膽紅素和腹水等生化指標均可間接反映肝纖維化的程度。在這種情況下，將CXCL10確定為肝纖維化進展的生物標志物可能是有用的，盡管尚未在肝纖維化中研究。

在本研究中，筆者評估了CXCL10 作為一種無創性性生物標志物來預測患者肝纖維化階段的能力。ALT 是肝臟炎癥最直接、最敏感、最經濟的指標，其水平升高通常提示肝臟炎癥的發生。筆者的數據顯示，肝硬化患者血漿CXCL10 水平與ALT、AST、PT、APTT、DD 呈正相關關系，說明肝功生化指標不能代替CXCL10 的檢測，肝硬化患者血漿CXCL10 水平是獨立于生化指標之外的。提示CXCL10 表達水平也可作為判斷有無肝臟損傷和凝血功能異常的指標，與肝硬化患者的肝功能障礙相關。肝硬化患者的凝血酶原時間（PT）和部分凝血酶原時間（PTT）均會延長，說明在肝功能障礙的背景下，促凝因子的合成會減少，CXCL10 表達水平可能也與凝血因子有關。高表達CXCL10 和低表達CXCL10 的肝硬化患者的檢驗結果如ALT、AST、PT、APTT、DD 存在顯著性差異，這表明肝臟損傷時肝細胞破壞釋放ALT、AST 的同時也促進CXCL10 表達上調，但具體機制需要進一步的探索和研究。肝硬化患者血漿CXCL10 水平較健康對照組明顯上升，肝內CXCL10 的表達隨著肝纖維化的進展而增加，表明CXCL10 也參與了肝臟炎癥的發生和發展。CXCL10 的ROC 曲線下面積為0.826 4，具有較好的診斷效能。因此CXCL10 可作為一種無創標志物，以避免肝活檢引起的并發癥。它可以反映肝臟動態變化，這可能有助于識別有進行性纖維化風險的患者，以便進行早期干預或保持更密切的監測。目前，尚缺乏血清特異性肝纖維化診斷指標，依單一血液指標對肝纖維化評估作用有限，CXCL10 可以聯合其他指標檢測和評估來提高診斷價值。然而，目前對CXCL10 缺乏相關的長期縱向臨床資料，難以在短期內應用于臨床。總之，根據本研究獲得的結果，CXCL10 可以作為反映肝臟功能障礙的生物標志物，CXCL10 與肝硬化有顯著相關性，因此可作為肝硬化患者的敏感生物標志物。