反復胚胎種植失敗人群母體全身因素對子宮內膜種植窗影響分析

白 云，鐘蘭萍，張婷婷，吳月蓉，李 蕾

（云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院生殖醫學科，云南 昆明 650032）

在輔助生殖技術中，胚胎的質量和子宮內膜容受性這2 個因素類似于“種子”和“土壤”的關系，是妊娠成功的關鍵因素。隨著體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization -embryo transfer，IVF）中實驗室技術的完善以及植入前遺傳學檢測技術（preimplantation genetic testing，PGT）的快速發展，目前在優質胚胎篩選方面已有較大進展，但是仍有一部分患者依然面臨反復的優質胚胎無法成功植入（repeated implantation failure，RIF）的棘手狀況。決定成功妊娠的另一重要因素子宮內膜容受性受到越來越多關注，子宮內膜容受性是指子宮內膜接受胚胎植入的能力，也表示內膜處于的一種狀態。一般認為在規律的月經周期中，只有在周期的第20～24 天或黃體生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7 天（LH+7）或出現孕激素升高后5 d（P+5）子宮內膜具備對胚胎的接受能力[1]。因此，常把這個時期形象地稱為胚胎著床的“窗口期”，顧名思義其僅在短期內開放，之后及時關閉胚胎便難以植入。越來越多的研究發現既往認為的種植窗恒定并非在所有患者中都成立，而表現為種植窗提前退后或縮短，隨著以高通量測序技術為基礎的基因轉錄組分析、全基因組關聯研究等現代分子基因診斷技術的不斷發展，結合機器學習所得的子宮內膜容受性檢測（endometrial receptivity test，ERT）技術隨之誕生[2]。ERT 技術能夠準確區分容受前期、容受期、容受后期三個時期樣本，容受前期和容受后期均被認為種植窗口移位。依據結果為給RIF 患者定制更準確的個體化胚胎移植（personalized embryo transfer，pET）方案。針對RIF 患者中可能影響種植窗的原因中，局部病理因素如宮腔內占位病變、輸卵管積水、子宮腺肌癥、慢性子宮內膜炎在行ERT 檢測前已行相關檢查排查且治療。那么ERT 結果中發生種植窗移位的反復移植失敗人群是否具有特定母體全身性因素影響子宮內膜容受性，目前尚無相關研究。本研究比較發生種植窗移位與非移位患者的臨床指標以探討種植窗移位的發病原因、應對策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

回顧性分析2020 年12 月至2022 年1 月在云南省第一人民醫院生殖醫學科診斷為反復種植失敗[3]并行ERT 檢測的病例。納入標準：（1）取卵年齡小于40 歲；（2）反復種植失敗的患者，即既往≥3 次的移植失敗，累積移植：優質D3 胚胎4～6 個或高評分囊胚（4BB 及以上囊胚）3 個及以上均失敗；排除標準：（1）男女雙方染色體核型異常；（2）有子宮內膜病變者（包括宮腔粘連、子宮內膜息肉、慢性子宮內膜炎、子宮內膜結核等）未治療；（3）有輸卵管積水且未行輸卵管近端結扎者；（4）有粘膜下肌瘤未處理。根據ERT 結果分為容受期組和非容受期組。

1.2 內膜監測及手術時間安排

月經來潮10～12 d B 超監測卵泡及內膜厚度，若有優勢卵泡發育監測至排卵，排卵+5 d 或出現LH 峰+7 d 安排內膜取材；若無優勢卵泡發育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（補佳樂，德國Bayer）2 mg，bid，用藥14 d，內膜≥8 mm 時給予黃體酮陰塞（安琪坦，法國Capsugel）0.2 g，bid，及地屈孕酮口服（達芙通，荷蘭Abbott）10 mg，bid，轉化內膜6 d 后安排內膜取材。

1.3 內膜取材手術

手術當天行陰道分泌物、血常規檢查。手術室患者取截石位，消毒鋪巾，宮頸鉗鉗夾宮頸上下唇固定宮頸，探針探查宮深，順子宮位置方向輕柔插入內膜取材取樣器，待取樣器底部達宮底處，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宮腔形成負壓吸取內膜組織。將取樣管中的子宮內膜組織排除至無菌紗布上，挑選干凈無血污染的內膜組織直接放入裝有RNA 保存液的保存管，放入-20 ℃保存，聯系送檢取樣。

1.4 觀察指標

1.4.1 患者一般資料包括年齡、身體質量指數（body mass index，BMI）、不孕類型（原發不孕占比）、不孕年限。

1.4.2 胰島素抵抗指數Homa IR=空腹血漿葡萄糖（mmol/L）×空腹血漿胰島素（mIU/L）/22.5；Homa IR ＞2.69診斷為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[4]。

1.4.3 維生素D水平按照美國醫學研究所制定的在健康人群中維生素 D 的標準[5]，維生素 D 缺乏指25-OHD＜ 50 nmol/L。

1.4.4 血栓前狀態避開月經期行凝血酶原時間（PT），活化部分凝血活酶時間（APTT），凝血酶時間（TT），D-二聚體，纖維蛋白/纖維蛋白原降解產物（FDP），蛋白C、蛋白S 活性，抗凝血酶Ⅲ活性，血漿凝血因子Ⅴ活性，同型半胱氨酸檢查，以上檢測項目一項或多項陽性診斷血栓前狀態（prethrombotic state，PTS）[6]。

1.4.5 抗磷脂抗體及抗核抗體抗磷脂抗體（antiphospholipid antibodies，aPLs，包括抗心磷脂抗體、抗β2-糖蛋白1 抗體，狼瘡抗凝物），抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）每12 周檢測2次，2 次抗體陽性視為陽性組。

1.4.6 甲狀腺功能促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）處于正常范圍，而甲狀腺自身抗體包括甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）陽性視為甲狀腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）。

1.5 統計學處理

本研究統計分析采用SPSS（version 26），計量資料符合正態分布用（±s）表示。當方差齊時，獨立樣本t檢驗比較組間差異，當方差不齊時采用Cochran 矯正t檢驗比較組間差異。計數資料用頻數和百分率表示，采用χ2檢驗進行分析。針對建模人群，采用Logistic 多元逐步回歸篩選預測指標。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組患者一般臨床資料比較

接受ERT 檢測并得到結果的病例中，非容受期組19 例，容受期組38 例。2 組患者的年齡、BMI、原發不孕占比、不孕年限，內膜準備方案（替代周期占比）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2 組病例一般資料的比較[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

表1 2 組病例一般資料的比較[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

2.2 2 組患者內膜種植窗移位相關因素單因素分析

2 組患者間ANA 陽性、維生素D 缺乏發生率無統計學意義（P＞ 0.05），而IR 發生率、aPLs 陽性率、非容受期組明顯高于容受期組（P＜ 0.05），見表2。

表2 2 組病例種植窗移位相關因素比較[n（%）]Tab.2 Comparison of related factors of implant window displacement between two groups [n（%）]

2.3 內膜種植窗移位相關因素Logistic 回歸分析

將單因素分析中IR、aPLs 陽性（P＜ 0.05）及TAI（P=0.056），PTS（P=0.067）進行Logistic 多因素回歸分析，最終IR、易栓癥、TAI 陽性進入回歸方程。三者為內膜種植窗移位的獨立危險因素，見表3。

表3 影響種植窗移位的Logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of influencing the displacement of planting window

3 討論

目前有研究認為，反復自然流產和反復種植失敗兩個綜合征可能有共同的發病機制[7]，免疫學因素、血凝因素、女性生殖道解剖結構異常以及內分泌異常被認為是自然流產中最重要的4 種母體病因[8]。生殖道解剖異常易于診斷，但自身免疫因素、血凝因素以及內分泌異常在反復種植失敗人群中所起的作用已逐漸引起重視，而上述因素是否通過對種植窗產生影響從而影響胚胎著床目前尚無研究。筆者的研究發現胰島素抵抗、血液高凝狀態和甲狀腺自身免疫是種植窗移位的危險因素。

3.1 胰島素抵抗對子宮內膜種植窗影響

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指外周組織對胰島素敏感性下降產生對葡萄糖的利用率降低的結果，為達到正常血糖水平機體代償性分泌胰島素，導致血液胰島素水平過高，即高胰島素血癥。既往的研究認為IR 對IVF 結局的影響主要體現在卵母細胞質量受損[9-11]，而本研究發現胰島素抵抗是種植窗移位的危險因素之一，Chang 等[12]通過比較合并IR 的多囊卵巢綜合征與不合并IR 的多囊卵巢綜合征接受IVF 助孕的治療結局，發現2 組間獲卵數、卵子成熟度、卵裂率和胚胎質量差異無統計學意義，但胚胎種植率、臨床妊娠率合并IR 組明顯低于不合并IR 組。有研究發現，胰島素抵抗、高雄激素與子宮內膜容受性標志物如αvβ3 整合素、同源框基因A10（homeoboxA10，HOXA10）、胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP-1）低表達有關[13-14]。分析其原因可能存在以下因素，高胰島素血癥會下調肝臟IGFBP-I，導致循環中游離IGF-I 升高。上述兩者水平升高可抑制子宮內膜間質分化的正常進程即子宮內膜蛻膜化，從而影響滋養層的侵襲和生長、免疫調節網絡與細胞因子環境[15]。近年來，子宮內膜局部IR 逐漸受到關注，妊娠建立的條件包括具有容受性的子宮內膜以及內膜胚胎的交互作用，在這個過程中葡萄糖攝取以獲得能量[16]是前提。子宮內膜局部IR 由于胰島素受體底物磷酸化、PI3K/蛋白激酶 B （Akt） 信號通路以及胰島素敏感的轉運蛋白GLUT-4 表達三者異常，由此發生的IRS/PI3K/Akt/G LU T-4 通路受損破壞蛻膜化過程能量穩態影響子宮內膜的葡萄糖利用[17]。以上可能是胰島素抵抗干擾正常種植窗開放，導致種植窗移位的原因。

3.2 血栓前狀態對子宮內膜種植窗影響

本研究單因素分析提示容受期與非容受期血栓前狀態比率無統計學差異，但放入多因素回歸分析則提示血栓前狀態是內膜種植窗移位的危險因素。凝血系統異常會導致出血或血栓形成，血栓形成前的高凝狀態稱為血栓前狀態（prethrombotic state，PTS）[6]。近年來，越來越多的研究支持RIF 與PTS 有關[18]，PTS 可能在一定程度上影響凝血-纖溶系統的平衡，導致凝血功能增強。Bellver 等發現[19]，凝血因子缺陷發生率在RIF 病例中較正常生育婦女顯著增高，亦有系統評價提示[20]RIF 與凝血因子缺陷顯著相關。Wen[21]研究發現血栓前狀態在黃體中期子宮內膜動脈血流得阻力明顯高于對照組，并且由于高凝狀態，子宮的血流速度處于高阻力狀態，從而導致內膜血流灌注不足，對內膜容受性產生影響，這也許是血栓前狀態影響內膜種植窗的主要原因。基于上述，Yang 等[22]建立了預測中國女性RIF的凝血檢查指標模型，發現凝血參數包括PT、APTT、TT 和AA 誘導的血小板聚集是RIF 的預測指標，強調了抗凝治療降低RIF 風險的潛力。

3.3 自身免疫性甲狀腺疾病對子宮內膜種植窗影響

臨床甲狀腺功能障礙，主要是出現甲狀腺自身抗體，包括甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）。既往不少研究發現：不孕癥女性人群中，TAI 發病率較對照組增加[23-24]。TAI 對輔助生殖結局影響研究結果目前存在較大爭議，Patriza 等[25]研究發現：TAI 組患者接受輔助生殖治療受精率、優胚率、臨床妊娠率均低于對照組，推測卵泡液中就已存在的甲狀腺抗體干擾了女性生殖。2016 年一項系統評價分析提示TAI 在輔助生殖中不影響獲卵、受精、胚胎形成，而是增加了流產率[26]，綜上TAI 對于內膜容受性影響并不明確。2017 年的一項研究[27]通過流式細胞學技術對比了正常人群和甲狀腺功能正常TAI 女性患者之間外周血單核細胞表型，發現TAI 組外周血中先天免疫的Th1 型變化，升高的NK 和NKT 樣細胞比率和增強的天然細胞毒性解釋了可能對妊娠結局包括內膜容受性具有負面影響的免疫狀態。

綜上所述，IR、PTS、TAI 是子宮內膜種植窗移位的母體全身性危險因素，該結果對于RIF 的預防和治療提供了新的思路和方向。同時，本研究存在一定的局限性，因研究樣本例數的限制，使部分結果缺乏統計學差異，后期擬進一步增加研究例數擴大研究范圍，完善相關參數的比較。