蝦青素明膠-阿拉伯膠微球的制備與質量評價

陳怡瑩，許征娣，姜 婕，程炳鐸，李元增，馬云淑,2,3?

（1. 云南中醫院大學 中藥學院，云南 昆明 650500；

2. 云南省高校藥食同用資源養生產品工程研究中心，云南 昆明 650500；3. 云南省高校外用給藥系統與制劑技術重點實驗室，云南 昆明 650500）

蝦青素（Astaxanthin）化學名稱為3,3'-二羥基-4,4'-二酮基-b'b-胡蘿卜素，是一種酮式類胡蘿卜素[1]，是從真菌、植物、鮭魚、蟹等多種來源中分離得到的天然產物[2]。其在體內外均有潛在的生物活性，是目前已知比維生素、胡蘿卜素有更強抗氧化能力的天然抗氧化劑[3]。大量研究表明，蝦青素在抗炎[4]、抗癌[5]、抗氧化[6]、抗疲勞[7]、增強免疫力[8]等方面具有較強的生物活性。其被用作食品、飼料或水產生產中的色素，也用于化妝品和制藥產品[9]。

盡管蝦青素因其多種生物學功能備受關注，但由于蝦青素水溶性差、疏水性強、熔點高、化學穩定性差等特點，很難有效地傳遞給器官[10]，造成其在生物體內的生物利用度較低，限制了蝦青素的應用。因此，關于蝦青素及其制劑的研究還有很大空間。目前，蝦青素已被制成脂質體、微膠囊、包合物、納米粒等制劑[11-12]，這些劑型都能增強蝦青素性能的優勢，包括穩定性、抗氧化潛力、生物活性和藥物釋放。《中國藥典》對微球劑定義為活性成分溶解或分散在輔料中形成的微小球狀實體（一般規定其粒徑范圍1～250 μm）[13]，微球劑可提高難溶性藥物溶解度和增強穩定性，能夠實現靶向給藥、緩控釋放藥物，抵抗紫外線、水分、氧氣等環境因素干擾特點。

本實驗研究采用明膠、阿拉伯膠為載體，通過乳化交聯法制備蝦青素微球，制備徑粒更小，更易于分散，且穩定性、包封率和載藥量較好的蝦青素微球，有效克服蝦青素易被氧化，性質不穩定，水溶性較差以及氣味難聞等問題，并對蝦青素微球制備工藝進行研究，同時也為開發各類載藥微球藥實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦青素油（蝦青素含量為5%）：昆明醫科大學；蝦青素分析對照品（純度≥98%）：北京索萊生物科技有限公司；丙酮（分析純）：汕滇藥業有限公司；戊二醛（分析純）、液體石蠟：天津市大茂化學試劑廠；吐溫80（分析純）：天津市風船化學品試劑科技有限公司；明膠：天津市軒昂科工貿有限公司；阿拉伯膠：天津市致遠化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；異丙醇（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

BT25S分析天平：賽多利斯儀器有限公司；SK3300超聲儀：上海科導超聲儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；winner2000激光粒度儀：濟南微納有限責任公司；光學顯微鏡：Nikon Eclipse Eloo；循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；UV-2000型紫外分光光度計：尤尼柯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蝦青素明膠-阿拉伯膠微球的制備方法

分別稱取15%明膠和阿拉伯膠，用10 mL水溶解后將兩者混合后混勻，在一定乳化溫度下加入蝦青素，在一定攪拌速度下，乳化10 min，制得蝦青素初乳；將適量含有2%司盤-80的液體石蠟50 mL加熱到與初乳相同的溫度，將蝦青素初乳緩慢倒入液體石蠟中，再乳化10 min，制成復乳；迅速將復乳放到0 ℃冰浴中，在攪拌下膠凝30 min，并加入0.75 mL濃度為50%戊二醛，交聯固化30 min，再加入40 mL異丙醇，脫水5 min，抽濾，用異丙醇洗滌，避光干燥[14]。即得紅色粉末。

1.3.2 蝦青素標準曲線的建立

精密稱定15.00 mg蝦青素分析對照品于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解，定容至刻度，超聲混勻；分別吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL蝦青素丙酮溶液加到10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻。以丙酮作為空白對照，在476 nm處用紫外分光光度法測定蝦青素對照品的吸光度A，以吸光度A對濃度C進行線性回歸。得到標準曲線方程為A=0.148 1C-0.052 9（R2=0.999 4）。

1.3.3 微球載藥量與包封率的測定方法

1.3.3.1 微球載藥量計算公式 微球載藥量 =W1/W2×100%

式中：W1：微球中蝦青素的含量 W2：蝦青素微球的總質量

1.3.3.2 微球包封率計算公式 微球包封率 =W3/W4×100%

式中：W3：微球中蝦青素總量 W4：蝦青素的投藥量

1.3.3.3 粒徑跨度計算 粒徑跨度（μm）=（D90-D10）/D50

式中：D10，D50和D90分別表示在粒徑累積分布圖中相應于累積頻率10%，50%和90%處的粒徑[15]。

1.3.4 蝦青素明膠-阿拉伯膠微球綜合評價方法

根據載藥量、包封率和粒徑跨度三個指標對微球制劑的影響，并對三個指標進行評分[16]。

綜合評分=[（各組載藥量/最大載藥量）× 0.5+（各組包封率/最大包封率）×0.2-（各組粒徑跨度/最大粒徑跨度）×0.3]×100

1.3.5 單因素考察

根據文獻查閱，選擇明膠/阿拉伯膠濃度、乳化溫度、載體與藥物的配比和攪拌速度作為影響因素，進行單因素實驗。

1.3.6 因素水平表

根據單因素考察的相關數據，以載藥量、包封率以及粒徑跨度作為指標，選擇明膠阿拉伯膠濃度、乳化溫度、載體與藥物的配比和攪拌速度四個因素進行正交實驗，因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3.7 蝦青素明膠-阿拉伯膠表觀微球形態及粒徑分布

1.3.7.1 微球形態觀察 按照制備工藝所得蝦青素微球經光學顯微鏡（物鏡和目鏡放大倍數均為100）和電子顯微鏡（真空條件下噴金）觀察微球形態。

1.3.7.2 微球粒徑分布 取0.1 g蝦青素明膠-阿拉伯膠微球，用100 mL純凈水分散后，超聲30 s使微球分散均勻，用winner2000激光粒度分析儀測量微球的粒徑分布。

1.3.8 蝦青素微球體外釋放

1.3.8.1 建立線性關系 精密稱取15.60 mg蝦青素分析對照品于25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，超聲混勻。分別移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL濃度62.4 μg/mL的蝦青素丙酮溶液加入到10 mL容量瓶中，分別加入丙酮至體積為l mL，用pH 7.4的PBS溶液稀釋至10 mL，得到濃度為0.312、0.624、2.496、3.744、4.992、6.240 μg/mL蝦青素分散介質的對照品溶液。將丙酮和pH 7.4的PBS溶液按照1∶9的體積比制備參比溶液，將對照品溶液在最大吸收波長476 nm處測吸光值，繪制標準曲線。方程為A=0.055 4C-0.000 6（R2=0.997 4）

1.3.8.2 蝦青素明膠-阿拉伯膠微球體外釋放度的測定 稱取100 mg載蝦青素微球加入透析袋中，加入含10%丙酮的PBS溶液（pH 7.4）3 mL，將微球分散，透析袋兩頭用夾子夾緊，放入轉籃內，加入150 mL含10%丙酮的PBS溶液（pH 7.4），攪拌速度為100 r/min，（37±0.5 ℃）恒溫水浴保溫，分別于0.5、1、2、4、6、8、10和24 h取樣5 mL，同時用5 mL新鮮的溶出介質進行補充，持續取樣24 h，實驗重復3次，結果取平均值，計算微球累計釋放率。利用紫外分光光度計測定取出上清液的吸光度值，并計算蝦青素的濃度，得出蝦青素的釋放率[17]。再稱100 mg蝦青素油（蝦青素含量為5%）作為對照，同上述方法測定蝦青素油的體外釋放率。累計釋放百分率公式為[18]：

式中：Ci為i時間點釋放介質中蝦青素的濃度，Ct為第n時間點釋放介質中蝦青素的濃度，Vi為取樣體積，V為釋放介質的總體積。

1.3.8.3 蝦青素微球釋藥模型 采用零級釋放模型、一級釋放模型、Higuchi方程的數學模型，對蝦青素明膠-阿拉伯膠微球累計釋放率數據進行擬合，求出相應特征指數。

1.4 數據分析

運用excel、Origin 2019等軟件對數據進行數據處理分析。

2 結果分析

2.1 蝦青素明膠-阿拉伯膠微球的制備單因素實驗結果

單因素實驗結果見表2～5。

表2 不同明膠/阿拉伯膠與蝦青素的比對綜合評分的影響Table 2 The effect of different ratios of gelatin/acacia and Astaxanthin on the comprehensive score

表3 不同乳化溫度對綜合評分的影響Table 3 The effect of different emulsification temperatures on the comprehensive score

表4 不同明膠/阿拉伯膠濃度對綜合評分的影響Table 4 The effects of different gelatin/gum arabic concentrations on the composite score

表5 不同攪拌速度對綜合評分的影響Table 5 The effect of different stirring speeds on the comprehensive score

2.2 蝦青素明膠-阿拉伯膠微球的制備正交實驗結果

根據表6數據可知，各因素對蝦青素明膠-阿拉伯膠微球包封率的影響大小順序是：A＞D＞C＞B，即：明膠-阿拉伯膠濃度＞攪拌速度＞載體與藥之比＞乳化溫度。確定的最佳處方工藝條件為A2B3C2D2，即明膠-阿拉伯膠溶液濃度為15%，乳化溫度為60 ℃，明膠-阿拉伯膠/蝦青素為4∶1，速度為600 r/min。

表6 蝦青素微球制備工藝的正交實驗結果Table 6 Orthogonal test results of Astaxanthin microspheres preparation process

2.3 方差分析

表7方差分析說明明膠-阿拉伯膠濃度對微球工藝有顯著影響，乳化溫度、明膠和阿拉伯膠/蝦青素油及攪拌速度對微球制備工藝無顯著性影響。

表7 蝦青素微球方差分析Table 7 Variance analysis of Astaxanthin microspheres

2.4 驗證實驗

按表8所得最佳制備工藝，進行三組平行，實驗結果顯示平均載藥量為9.91%，平均載藥量為93.28%，與正交實驗預測值基本一致。說明工藝合理，可行性較好。

表8 蝦青素微球制備工藝驗證實驗結果Table 8 Verification results of Astaxanthin microspheres preparation process %

2.5 蝦青素微球形貌特征及體外釋放結果

2.5.1 蝦青素微球形貌特征

根據最佳工藝制備，得到的蝦青素微球外觀圓整，為紅色，分散性良好，較少粘連。經光學顯微鏡（物鏡和目鏡放大倍數均為10）和電子顯微鏡觀察，蝦青素完全包裹在微球中，電鏡下的微球有少量孔洞，可能在干燥過程中溶劑揮發所致。

圖1 蝦青素微球顯微圖（×100）Fig.1 Microphotograph of Astaxanthin microspheres (×100)

2.5.2 微球粒徑分析結果

由圖3可知蝦青素微球粒徑分布在0～160 μm之間，平均粒徑為39.75 μm，此條件下，微球粒徑分布較為均勻，分散性較好。

圖2 蝦青素微球掃描電鏡照片（×1 000）Fig.2 SEM photographs of Astaxanthin microspheres (×1 000)

圖3 蝦青素微球粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of Astaxanthin microspheres

2.5.3 微球體外釋放率測定結果

在pH=7.4的PBS丙酮溶液中，蝦青素明膠-阿拉伯膠微球的溶解度明顯高于蝦青素油，將蝦青素油制成微球，釋放時間第1 h時，微球釋放率明顯增強。累計釋放率24 h達到51.94%，而蝦青素油的累計釋放率僅2.57%；蝦青素油存在釋藥速度過慢的問題，無法滿足人體吸收代謝的需要。因此，蝦青素油要滿足食用或者藥用等需求，制成微球可行。

圖4 蝦青素微球體外釋放實驗結果Fig.4 Results of in vitro release of Astaxanthin microspheres

2.5.4 微球體外釋藥模型

由表9可知一級釋放模型的R2值為0.979 1，說明其擬合程度最高，體外釋藥規律符合一級模型。

表9 蝦青素微球釋藥模型擬合結果Table 9 Fitting results of astaxanthin gelatin-gum arabic microsphere release model

3 結論

本研究通過單因素實驗考察了明膠-阿拉伯膠濃度、油水體積比、攪拌速度、乳化溫度4個因素，在單因素考察的基礎上，對較大的影響因素設計正交實驗，得出最佳工藝方案——載體與藥比為4∶1，明膠阿拉伯膠濃度為15%，乳化溫度為60 ℃。在此方案下所制得的蝦青素微球圓整，粒徑大小較均勻，分散性良好，較少粘連。通過紫外分光光度法測定微球中的藥物含量，計算得平均載藥量為9.91%，平均包封率達93.28%。電鏡掃描下，微球表面有明顯的孔洞，在測定累計釋放率時在第2 h出現明顯的突釋現象，24 h累計釋放率達51.94%，說明微球具有明顯的緩釋效果。結果表明，使用明膠-阿拉伯膠作為載體制作微球是可行的，所得微球載藥量和包封率都較高。

采用乳化交聯法制作蝦青素微球，步驟簡單，重現性好，易于操作[19]。以明膠阿拉伯膠作為載體價格低廉，其來源廣、無毒、可生物降解，有利于進行大規模的研究和生產。明膠水溶液中可離解出正離子（-NH3+）和負離子（-COO-）；阿拉伯膠水溶液中，分子僅離解出負離子（-COO-），攜帶負電荷[20]，二者結合有利于蝦青素包合進入載體中，增加蝦青素微球的穩定性。考慮是由于微球之間交聯過度，相鄰微球之間的一些基團相互交叉，分子與分子相互糾纏，從而導致了微球粘連，使被包封藥物容易滲出。同時該方法與其他方法制備的蝦青素微球相比，具有設備簡單，原料來源豐富，產率高等優點，證明了使用此方法制備蝦青素微球有廣闊的應用前景。