蛋白核小球藻的培養及應用研究

岳海艷，劉小杰?，孫 敏，李 娜，劉占峰

（1. 上海城建職業學院，上海 201415；2. 上海化工研究院有限公司，上海 200062）

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，是一種球形單細胞淡水藻類，通常以光合自養生長繁殖，分布極廣。蛋白核小球藻含有豐富的蛋白質、維生素、礦物質、食物纖維、核酸、不飽和脂肪酸及葉綠素等，具有降脂、降壓、降血糖、預防和改善動脈粥狀硬化等功能[1-2]，尤其小球藻特有的生長因子，使其具有排除體內毒素、促進新陳代謝、補充人體營養、提高細胞再生能力以及增強人體免疫力等功效[3-5]；美國和日本將小球藻作為優良食品和動物飼料添加劑已有30多年的歷史，近年來，東亞和歐洲每年生產數千噸的小球藻作為飼料添加劑、保健食品和營養補充食品[6]。2012年底《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》將蛋白核小球藻列為新資源食品[7]，豐富了國內藻類健康食品種類，已經應用于大米、釀酒、豆腐、發酵乳制品、面條、餅干和面包等[8-12]，將來在功能性食品中必然有著更廣闊的應用前景[13]。

目前蛋白核小球藻培養方法很多，其培養方式包括密閉無菌培養法、開放半無菌培養法、開放藻菌混養法等[14-20]。生長方式有自養和異養生長兩種，隨著碳氮比（C/N）和光照條件變化在自養和異養之間自由轉變[21]。由于開放和半開放培養方式容易使雜菌，尤其是有害細菌進入，并繁殖，使菌體遭到污染，不宜食用；自養向異養轉化過程伴有葉綠素和葉綠體的消失，類胡蘿卜素和葉黃素降低，蛋白質含量減少以及脂肪急劇增加等問題[22]。因此本文探索一種利用氣升反應器高密度培養食品用蛋白核小球藻的方法，即采用密閉無菌的自養方式，并首次將獲得的蛋白核小球藻用于青團制作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FAZHB-5小球藻：中科院水生生物研究所；硝酸鈉（AR）、硫酸鉀（AR）、檸檬酸鐵銨（CP）、鎢酸鈉（AR）、濃硫酸（AR）、硝酸（AR）等：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀（AR）、氯化鈣（AR）、乙二胺四乙酸二鈉（AR）：上海展云化工有限公司；鉬酸鈉（≥99%）：上海化學試劑有限公司；硫酸鎂（AR）：上海強盛功能化學股份有限公司；鐵質除氧劑：上海化工研究院有限公司；糯米粉、水晶餃子粉以及豆沙餡等：市售；AccQ.Tag分析蛋白水解氨基酸方法試劑包：濟南賽暢科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

IRH-IS160二氧化碳培養/振蕩培養一體箱：北京陸希科技有限公司；大容量離心機：UNION 5KR Hanil Science Industrial Co., Ltd；CX41顯微鏡：Olympus Optical Co.，LTD；TGL-16aR臺式冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；BCD626WD11HP容聲冰箱：海信容聲（廣東）冰箱有限公司；MP1002電子天平：上海民橋電子儀器廠；HX12L-0179立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫用核子儀器有限公司；GY-FYQ-1812-ZZ微藻培養光生物反應器：上海光語生物科技有限公司；海能K1100全自動凱氏定氮儀：上海力晶科學儀器有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀：廣州儀德精密儀器股份有限公司；電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）：PerkinElmer Avio200，MA，USA。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白核小球藻培養工藝

將FAZHB-5小球藻接種于無菌發酵培養基中，裝置密閉，氣體裝置內循環，根據設置自動通入無菌二氧化碳，保持裝置內二氧化碳2%濃度，氧氣21%，溫度25 ℃，12 h光照/d，培養8 d。

1.3.2 碳源和氮源優化

采用單因素實驗，以FAZHB-5小球藻為出發菌株，BG11為培養基，100 mL/250mL錐形瓶裝液量，轉速100 r/min，在二氧化碳培養/振蕩培養一體箱中12 h光照/24 h培養4 d，考察二氧化碳不同濃度對小球藻生長的影響。

采用單因素實驗，以FAZHB-5小球藻為出發菌株，2%二氧化碳作為碳源，固定BG11培養基中除硝酸鈉以外其他成分，100 mL/250 mL錐形瓶裝液量，轉速100 r/min，在二氧化碳培養/振蕩培養一體箱中12 h光照/24 h培養4 d，觀察不同硝酸鈉加入量對菌體生長影響。

1.3.3 培養基以及均勻設計

BG11培養基（g/L）：NaNO31.5，K2HPO40.04，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，檸檬酸0.006，檸檬酸鐵銨0.006，EDTANa20.001，Na2CO30.02，A51 mL。

A5（痕跡金屬，g/L）：H3BO32.86，MnCl2·4H2O 1.86，ZnSO4·7H2O 0.22，Na2MoO4·2H2O 0.39，CuSO4·5H2O 0.08，Co(NO3)2·6H2O 0.05，pH 7.1。

在二氧化碳含量、溫度、光照以及培養時間不變，借鑒BG11培養基并參考相關文獻[14-20]，采用10因素12水平均勻設計，見表1。依次改變硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等培養基成分含量，測定不同培養基組成條件下的干菌體質量。

表1 均勻設計要素Table 1 The essential factor for the uniform design

1.3.4 光源選擇

設備配備了內置和外置LED光源，白色：10 000 lux；紅∶藍為4∶1的彩光：5 000 lux。

1.3.5 超量氧氣去除方法

采用鐵質除氧劑吸收過量氧氣。

1.3.6 干菌體重量將一定體積的培養液經4 000 r/min離心20 min，棄上清液，收集濕菌體，經80 ℃烘干至恒重，利用精密電子天平稱重。

1.3.7 蛋白核小球藻營養成分測定

1.3.7.1 采用全自動凱氏定氮儀檢測蛋白核小球藻蛋白質含量 依據GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》第一法，將10 mL濃硫酸和1片催化劑（0.5 g硫酸銅和6 g硫酸鉀）加入到裝有0.5 g蛋白核小球藻粉的消化管中，200 ℃消化1 h，然后420 ℃繼續消化1 h；消化液冷卻后上機。

1.3.7.2 利用全自動氨基酸分析儀測定氨基酸組成和含量 將50 mg小球藻粉加入到1 mL 6 mol/L鹽酸中，110 ℃酸解24 h。取200 μL液體加入535 μL 2 mol/L氫氧化鈉中和，用AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液稀釋2倍。取上述溶液10 uL加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑中，55 ℃加熱10 min，冷卻后上機。

1.3.7.3 采用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）測定礦物質元素含量 稱取25 mg小球藻，加入到裝有1 mL硝酸溶液的硝煮管中，沸水蒸煮1 h，加去離子水定容至10 mL，用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）測定礦物質元素。

光譜條件：低波范圍5；高波范圍5；最大積分時間30 s；樣品沖洗時間30 s；重復次數3；泵延時間 5 s。

1.3.8 蛋白核小球藻青團配方

基礎配方（g）：糯米粉150，水晶餃子粉（澄面）50，豬油10，海藻糖 30，水180，豆沙餡250。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌體生長影響

自養培養的小球藻，二氧化碳既作為碳源，又是光合作用的底物，其濃度影響著菌體的生長以及淀粉的累積，在一定范圍內，光合作用速率隨二氧化碳濃度升高而加快，但達到一定濃度后，光合作用速率不再加快，這主要是因為高濃度的二氧化碳易使培養基酸化，抑制了菌體生長。

二氧化碳不同濃度對小球藻生長的影響，實驗結果見表2。從表2的結果可以看出，二氧化碳濃度在0.4%到2%區間內，隨著二氧化碳濃度提高，小球藻菌體量（以OD值表示）不斷提高，但當二氧化碳濃度超過2%后，反而不利用于菌體生長，因此下面的研究中，選擇2%濃度二氧化碳作為碳源的最適濃度。

表2 二氧化碳通氣量對小球藻生長影響Table 2 Effect of carbon dioxide aeration rate on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.2 氮源對菌體生長影響

小球藻能夠利用硝酸鹽作為氮源，進行生長，并合成蛋白質、淀粉等[23]，不同硝酸鈉加入量對菌體生長的影響，實驗結果如表3所示。從表3的結果可以看出，10 g/L的硝酸鈉更適合小球藻生長。繼續提高硝酸鈉的添加量，菌體生長反而受到抑制，其作用機理有待進一步研究。

表3 硝酸鈉加入量對小球藻生長影響Table 3 Effect of sodium nitrate addition on the growth of Chlorella pyrenoidosa

2.3 培養基優化

小球藻培養基主要以碳源、氮源和無機鹽為主，在以FAZHB-5小球藻為出發菌株，2%二氧化碳作為碳源，100 mL/250 mL錐形瓶裝液量，轉速100 r/min，在二氧化碳培養/振蕩培養一體箱中12 h光照/24 h培養4 d，通過對磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸鉀、檸檬酸鐵胺、氯化鈣、維生素B1、EDTANa2、鎢酸鈉、氯化鎳進行如表1的10因素12水平均勻實驗，獲得了優化后的培養基成分，實驗設計和結果見表4。

對表4的數據進行二次多項式逐步回歸分析，得出擬合線性回歸方程如下：

表4 均勻實驗設計及結果Table 4 The design and results of uniform experiment

Y=1.3X1+0.006X2+0.2X3+7.0X4+0.01X5+2.0X6+0.01X7+0.001X8+4×10-5X9+ 6×10-5X10，

其中：R2= 0.999 998，F = 159 230 7，P= 0.000 6。

從而可以獲得優化后的培養基組成：磷酸氫二鉀0.6 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硝酸鈉11 g/L，硫酸鉀0.8 g/L，檸檬酸鐵胺0.006 g/L，氯化鈣0.05 g/L，維生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，鎢酸鈉0.08×10-3g/L，氯化鎳0.02×10-3g/L，理論上可以獲得8.500 g/L干菌體。

以2%二氧化碳為碳源，按照優化培養基組成，利用密閉的氣升式生物反應器為培養裝置，在控制無菌二氧化碳進入情況下，氣體內部循環，進行3次重復培養，測得菌體干重分別為8.539、8.648和8.407 g/L，基本達到甚至超過優化水平，與模型預測值較接近，說明該回歸方程較可靠。

2.4 光源種類和位置對小球藻菌體干重的影響

葉綠素是與光合作用有關的最重要的色素，它可從光中吸收能量，用來將二氧化碳轉變為碳水化合物淀粉。葉綠素a、葉綠素b的吸收光譜有兩個，分別為波長630～680 nm的紅光區和波長為400～460 nm的藍紫光區[24]。常用的LED白光，本身發出的是450 nm的光，相較于葉綠素所需，紅光部分利用率偏低。

實驗采用上述優化培養基配方，利用密閉的氣升式生物反應器為培養裝置，在控制無菌二氧化碳進入情況下，氣體內部循環，光源為LED白光（10 000 lux）和紅藍彩光（4∶1，5 000 lux），放置在裝置內中心位置和四周位置。通過調整光源種類和位置，考察光源種類和位置對小球藻菌體干重的影響，實驗結果如表5所示。

表5 不同光源和位置的光照實驗Table 5 Experiments of different light sources and positions

從表5的實驗結果可以看出，增加四周光照后，菌體干重比僅有中心光源增加了70%，而中心彩色LED燈的更換，使菌體干重提高了1.8倍，比最初提高了3倍以上，效果非常明顯；實驗也發現，四周及中心全部采用彩光，菌體干重提高效果并不理想。將來全光譜的LED燈會更好地應用到藻類培養中。

2.5 氧氣量對小球藻菌體干重的影響

氧氣濃度過高，抑制小球藻生長[25]。如果不加控制，發酵8 d，氧氣量最高可到40%左右，因此采用除氧劑吸收過量的氧氣。不同氧氣濃度對菌體干重的影響如表6所示，從表6的實驗結果可以看出，氧氣量20%更適合菌體生長，幾乎是空氣中氧氣濃度。氧氣量過高或過低都產生抑制，這與文獻報道基本一致。

表6 不同氧氣量對菌體生長影響Table 6 Effect of different oxygen content on cell growth

2.6 蛋白核小球藻營養成分檢測

2.6.1 蛋白核小球藻蛋白質含量測定

根據GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》第一法，采用全自動凱氏定氮儀，測得蛋白核小球藻蛋白質含量高達58 g/100g，驗證了密閉自養培養方式，可以獲得蛋白質含量更高的蛋白核小球藻，這與前人的研究報道一致[26]。

2.6.2 氨基酸含量測定

利用氨基酸測定儀檢測了蛋白核小球藻氨基酸含量，結果表明蛋白核小球藻含有豐富的氨基酸，測定結果見表7。

表7 蛋白核小球藻氨基酸含量Table 7 Amino acid content of Chlorella pyrenoidosa

從蛋白質和氨基酸檢測結果可以看出，蛋白核小球藻均高于世界衛生組織（WHO）和聯合國糧農組織（FAO）頒布的用于人類營養的蛋白質標準，是一種優質蛋白質資源[27]。

2.6.3 蛋白核小球藻礦物質元素含量測定

根據GB5009.268—2016《食品安全國家標準食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）檢測該蛋白核小球藻中礦物質的含量。測定結果顯示：礦物質元素K、Ca、Mg等含量豐富；重金屬Pb、Cr和Cd含量均未超標，符合新資源食品要求，具體結果見表8。

表8 蛋白核小球藻中主要礦物質元素含量Table 8 Main mineral element content in Chlorella pyrenoidosa

2.7 蛋白核小球藻青團制作

根據基礎配方，在其它配料用量不變，通過改變蛋白核小球藻的添加量，已經獲得了顏色翠綠、不油膩、彈性好、口感好、無堿味等優點的蛋白核小球藻青團。

3 結論

1）單因素優化獲得碳源為2%二氧化碳，氮源為10 g/L的硝酸鈉；均勻設計獲得優化的培養基：磷酸氫二鉀0.6 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硝酸鈉11 g/L，硫酸鉀0.8 g/L，檸檬酸鐵胺0.006 g/L，氯化鈣0.05 g/L，維生素B10.11 g/L，EDTANa20.01 g/L，鎢酸鈉0.08×10-3g/L，氯化鎳0.02×10-3g/L。

2）實驗證明氧氣量為20%時，是菌體最適宜的生長環境，LED紅藍4∶1彩光替代白光，有效地彌補了白光中紅藍色的不足，更有利于光合作用進行。

3）蛋白核小球藻粉蛋白質含量高達58 g/100g，同時含有豐富的賴氨酸、胱氨酸、丙氨酸、礦物質元素K、Ca、Mg等。

4）利用獲得的蛋白核小球藻，制作了蛋白核小球藻青團，拓展了蛋白核小球藻在食品工業中的應用領域。