圣草酚對高脂飲食誘導的糖尿病大鼠肝損傷的保護作用及機制探討*

楊敏，張鋒，付姣，皮志杰，何麗

（1.十堰市太和醫院兒科，十堰 442099；2.武漢科技大學附屬醫院兒科，武漢 430064）

糖尿病是一種多因素代謝性疾病，具有高血糖、高發病率、高致殘率等特征[1]。胰島素是機體唯一具有降低血糖作用的激素，當胰島素分泌不足時，機體長期處于高血糖的狀態，氧化應激及炎癥反應相應增強，導致器官功能性障礙[2]。其中，肝是調節血糖的主要場所，血糖水平異常，患者易發展成肝損傷、肝炎、肝硬化甚至肝癌[3]，嚴重威脅患者生命。

據研究，中藥活性成分在治療糖尿病肝損傷方面具有良好效果，比如人參皂苷Rg1[4]、槲皮素[5]、白藜蘆醇[6]、黃芪和葛根[7]等。圣草酚是一種天然黃烷酮亞類的類黃酮，廣泛存在于具有潛在健康重要性的多種藥用植物中，如柑橘類水果和蔬菜[8]。藥理活性廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤[9]等作用。此外，圣草酚對多種肝臟疾病有良好的治療效果，比如減弱乙酰氨基酚誘導的肝毒性、緩解飲食誘導的小鼠肝臟脂肪變性[10]。據報道，圣草酚對糖尿病及其并發癥具有一定的治療作用[11]，但未見對糖尿病肝損傷的相關報道。因此，本研究通過建立相關實驗模型，探討圣草酚對高脂飲食誘導的糖尿病大鼠肝損傷、氧化應激及胰島素抵抗的影響，以期為糖尿病肝損傷的臨床治療提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠60 只，5 周齡，體質量200～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號：SYXK（京）2017-0033。實驗經十堰市太和醫院動物管理倫理委員會討論通過，倫理編號：IACUC2020-045。

1.2 藥物與試劑 圣草酚（純度≥98%）購自成都普菲德生物技術有限公司（貨號為CAS：552-58-9）；鏈脲佐菌素（STZ）購自上海如吉生物科技公司（貨號為CAS：18883-66-4）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）試劑盒購自上海紀寧生物科技有限公司（貨號分別為D-5001、D-2001、H-5011、H-2031）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司（貨號為QS-071、QS-051）；原位末端標記技術（TUNEL）試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司（貨號為K374-104）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（貨號為QPBCA-1KT）；B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2，ab182858，1∶2 000）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax，ab32503，1∶1 000）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，ab183218，1∶1 000）相關抗體購自英國Abcam 公司；TBST 緩沖液、4%多聚甲醛購自北京華越洋生物科技有限公司（貨號為C1067-002、C1042-014）；RIPA 裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司（貨號為C1053-100）；蘇木精-伊紅（HE）染色液、3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）染色液、蘇木素染色液購自北京博蕾德生物科技有限公司（貨號分別為DH0006、DH0032、DH0058）。

1.3 主要儀器 SpectraMax iD5 多功能酶標儀購自美國Molecular Devices 儀器公司；HGM-114 血糖儀購自蘇州爾達醫療設備有限公司；XSP-SG-63X 光學顯微鏡購自上海光學儀器一廠；Avanti JXN-30/26智能型高效離心機購自美國Beckman Coulter 公司。

2 方法

2.1 動物分組與造模 參考文獻方法[12-13]，將50 只雄性SD 大鼠適應性飼養1 周后，10 只作為正常組，喂養正常飼料，剩余40 只大鼠喂養高脂飼料，4 周后腹腔注射STZ 30 mg/kg 建立高脂飲食聯合低劑量STZ 誘導的糖尿病模型，1 周后檢測大鼠空腹血糖（FBG），高于7.0 mmol/L 提示造模成功，淘汰未成模大鼠后隨機分為4 組：模型組、低劑量組（圣草酚2.5 mg/kg）、中劑量組（圣草酚5 mg/kg）、高劑量組（圣草酚10 mg/kg），每組10 只大鼠。各給藥組分別腹腔注射2.5、5、10 mg/kg 圣草酚，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，每日1 次，共8 周。末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，麻醉處理，腹主動脈取血后處死，迅速解剖取出肝臟，用預冷的生理鹽水清洗。取部分用4%多聚甲醛固定，剩余組織勻漿處理。

2.2 評估胰島素抵抗相關指標 給藥結束后，各組大鼠禁食12 h 后，使用血糖儀檢測空腹血糖（FBG），采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定空腹胰島素（FINS），并根據胰島素抵抗指數（HOMA-IR）公式計算，HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。

2.3 試劑盒檢測肝功能生化指標水平 檢測AST、ALT、LDL、HDL 水平，按照相關試劑盒說明書操作，采用酶標儀進行檢測。

2.4 HE 染色觀察肝組織病理形態 取固定處理的肝臟組織，進行脫水、包埋、制片、HE 染色，并在光學顯微鏡下觀察、拍攝。

2.5 試劑盒檢測氧化應激標志物水平根據SOD、MDA 試劑盒說明進行檢測。

2.6 TUNEL 觀察肝細胞凋亡情況 根據TUNEL試劑盒說明進行操作，并在光學顯微鏡下觀察、拍攝。

2.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測凋亡相關蛋白表達 取制備的肝組織勻漿液，加入RIPA 裂解液，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，煮沸變性后獲取上樣樣本，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉膜、封閉后，采用Bax、Bcl-2 相關抗體孵育，TBST 沖洗后，采用電化學發光（ECL）進行顯影，分析相應灰度值。

2.8 免疫組化法檢測TNF-α 水平 取固定處理的肝臟組織，進行切片、二甲基脫蠟、水化、熱修復處理后，在正常的山羊血清工作液中封閉10 min；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后，滴加TNF-α 相關一抗孵育1 h；繼續用PBS 清洗，滴加二抗孵育20 min；PBS 清洗，加入DAB 染色及蘇木素復染，經乙醇脫水至透明后，中性樹膠封片。

2.9 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件對結果進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 圣草酚對糖尿病大鼠一般行為學的影響 正常組大鼠狀態良好，皮毛光澤，活動、進食、排便正常；模型組大鼠皮毛雜亂，有糖尿病“三多一少”的癥狀出現，進食量、排便量增加，活動量減少，慵懶，精神不佳；與模型組相比，各給藥組大鼠狀態有一定改善。

3.2 圣草酚對糖尿病大鼠胰島素抵抗相關指標的影響 與正常組相比，模型組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，除圣草酚低劑量組差異不具有統計學意義外（P＞0.05），其余兩組胰島素抵抗相關指標均有不同程度的降低（P＜0.05），提示圣草酚能夠降低糖尿病大鼠的胰島素抵抗，延緩病情進展。見圖1。

圖1 圣草酚對糖尿病大鼠胰島素抵抗相關指標的影響（±s，n=10）

3.3 圣草酚對糖尿病大鼠肝功能指標的影響 與正常組相比，模型組大鼠AST、ALT、LDL 水平升高，HDL 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，除圣草酚低劑量組差異不具有統計學意義外（P＞0.05），其余兩組AST、ALT、LDL 水平降低，HDL 水平升高（P＜0.05），提示圣草酚能夠調節轉氨酶及脂質水平，緩解糖尿病大鼠肝損傷程度。見圖2。

圖2 圣草酚對糖尿病大鼠肝功能指標的影響（±s，n=10）

3.4 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織病理形態的影響 正常組大鼠肝臟組織結構完整，肝細胞未見水腫，形態正常；模型組大鼠肝臟組織結構紊亂，排列不規則，部分可見壞死或空泡樣變性，多見炎癥灶浸潤，肝組織損傷明顯；與模型組相比，3 個給藥組大鼠肝臟組織病理形態有一定的改善，其中圣草酚高劑量組大鼠的肝組織結構與肝細胞形態趨于正常，提示圣草酚能夠減輕糖尿病大鼠肝組織的病理形態，緩解肝臟損傷程度。見圖3。

圖3 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織病理形態的影響（×400）

3.5 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織氧化應激指標的影響 與正常組相比，模型組大鼠SOD 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，除圣草酚低劑量組差異不具有統計學意義外（P＞0.05），其余兩組SOD 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05），提示圣草酚能夠提高抗氧化酶活性，減少過氧化反應，緩解糖尿病大鼠氧化應激程度。見圖4。

圖4 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織氧化應激指標的影響（±s，n=10）

3.6 圣草酚對糖尿病大鼠肝細胞凋亡的影響TUNEL 染色后，正常細胞的細胞核不著染，而凋亡細胞的細胞核被著染為黃色或棕黃色，并且具有細胞變小、細胞核固縮的改變。正常組大鼠肝細胞正常排列，少見凋亡細胞；模型組大鼠陽性凋亡細胞數目增多，細胞核固縮程度較嚴重；與模型組相比，3 個給藥組大鼠肝細胞凋亡狀態有一定程度的緩解，提示圣草酚能夠緩解糖尿病大鼠肝細胞凋亡。見圖5。

圖5 圣草酚對糖尿病大鼠肝細胞凋亡的影響（×400）

3.7 圣草酚對糖尿病大鼠肝細胞凋亡相關蛋白表達量的影響 與正常組相比，模型組大鼠Bax/Bcl-2比值升高；與模型組相比，除圣草酚低劑量組差異不具有統計學意義外（P＞0.05），其余兩組Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05），提示圣草酚能夠緩解糖尿病大鼠肝細胞凋亡狀態，保護肝細胞，與“3.6”項結果吻合。見圖6。

圖6 圣草酚對糖尿病大鼠肝細胞凋亡相關蛋白表達量的影響（±s，n=10）

3.8 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織TNF-α 陽性表達的影響 TNF-α 的表達部位定位在細胞核、細胞質，陽性物質呈棕黃色，陰性無染色。免疫組化染色顯示，模型組的染色程度較大，而各給藥組的染色程度均有一定程度減輕，其中圣草酚高劑量組趨向于正常組，提示圣草酚能夠緩解糖尿病大鼠炎癥反應，緩解肝損傷。見圖7。

圖7 圣草酚對糖尿病大鼠肝組織TNF-α 陽性表達的影響（×400）

4 討論

據統計，糖尿病已經成為全球第七大死亡原因，其發病率逐年上升，并呈年輕化趨勢，預計到2035 年全世界糖尿病患者將達到5.92 億，已成為嚴重威脅人類健康的全球性公共衛生問題[14]。目前，糖尿病的治療已取得良好進展，但其毒副作用也不容忽視，常引起潴留、肥胖、視網膜病變、抑郁等癥狀[15-16]。圣草酚是一種天然黃酮類化合物，藥理活性廣泛，本研究探討其對高脂飲食誘導的糖尿病大鼠肝損傷、氧化應激及胰島素抵抗的影響。

當肝臟、脂肪等靶組織對胰島素的敏感性下降時會出現胰島素抵抗，導致血糖代謝紊亂，促使機體處于氧化應激狀態，產生過量自由基，導致肝細胞損傷。AST、ALT 被釋放入血，其含量間接反映肝細胞損傷程度[17]。此外，氧自由基與脂質發生過氧化反應生成MDA，促進脂質代謝，而機體中的SOD 具有較強的抗氧化能力，可抑制氧自由基的生成，減輕對肝細胞的損害，并且降低MDA 的生成[18]。人體血漿內包括膽固醇、三酰甘油等，膽固醇和脂蛋白結合后才能被運送到體內各個部位，LDL 將膽固醇從肝臟運送至全身組織，HDL 將各組織的膽固醇運回肝臟代謝。因此，LDL、HDL 水平是反映機體脂質代謝的重要指標[19]。Yang 等[20]研究顯示，降糖顆粒通過減輕糖脂代謝紊亂和氧化應激發揮對糖尿病所致肝損傷的保護作用。本實驗中圣草酚可以降低FBG、FINS、HOMA-IR，同時能夠降低AST、ALT、LDL 水平，升高HDL 水平，增強SOD 活性，減少MDA含量，提示圣草酚可以抑制胰島素抵抗，降低轉氨酶活性，促進脂質代謝，提高抗氧化能力，緩解氧化應激反應，發揮對糖尿病肝損傷的保護作用。

肝損傷疾病的重要特征是細胞凋亡，促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl-2 的比例能夠反映細胞凋亡趨勢。TNF-α 是一種促炎及促凋亡的細胞因子，在誘導糖尿病發生的過程中起重要作用[21]。Safhi等[22]研究顯示馬尾藻通過抑制細胞因子及凋亡途徑發揮對糖尿病大鼠肝臟損傷的保護作用，本實驗中圣草酚可以降低凋亡率及Bax/Bcl-2 比值，降低TNF-α 表達，減輕細胞凋亡，提示圣草酚能夠抑制肝細胞凋亡，發揮保護肝臟的作用。

綜上所述，圣草酚對高脂飲食誘導的糖尿病大鼠肝損傷具有保護作用，其機制可能與抑制胰島素抵抗、降低轉氨酶水平、促進脂質代謝、提高抗氧化能力、緩解氧化應激、調控細胞因子表達、抑制組織炎癥及肝細胞凋亡等有關。圣草酚對糖尿病肝損傷的治療效果顯著，具有深入研究的潛在價值及現實意義。