土茯苓-槐花藥對治療銀屑病作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

李騰飛 周妍妍 楊素清 閆景東△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

銀屑病又稱“牛皮癬”，是一種常見且又容易復(fù)發(fā)的系統(tǒng)性、炎癥性皮膚病。銀屑病臨床表現(xiàn)為顯著紅斑的基礎(chǔ)上覆蓋多層白色鱗屑，可累及皮膚、關(guān)節(jié)、甲等各個部位。因其病情反復(fù)、根治不易，對患者機體以及精神產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。經(jīng)調(diào)查表明，該疾病在我國的總患病率由1984年的0.123%增長至2010年0.470%[1]，而全球銀屑病的總患病率介于0.09%～5.10%之間[2]。雖然本病的發(fā)生機制尚未定論，但免疫學(xué)和遺傳學(xué)研究已經(jīng)確定白細胞介素-17（IL-17）和白細胞介素-23（IL-23）是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵驅(qū)動因素，環(huán)境為其促發(fā)因素[3]。查閱古代中醫(yī)文獻發(fā)現(xiàn)銀屑病與“白疕”最為相似，如《外科證治全書》記載白疕“皮膚瘙癢，起如疹疥而色白，搔之屑起”[4]。趙炳南認為銀屑病在治療上應(yīng)該從血熱、血燥以及血瘀出發(fā)，其中又屬血熱型最常見，故清熱涼血解毒法為治療銀屑病的主要研究思路之一[5]。

土茯苓-槐花藥對是中醫(yī)皮膚科常用藥對，具有除濕清熱解毒的功用，來源于土槐飲，出自《趙炳南臨床經(jīng)驗集》[6]。土茯苓性味甘、淡、平，歸肝、胃、脾經(jīng)，具有解毒除濕、通利關(guān)節(jié)的作用，其在調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等方面均有顯著的藥理作用[7]。槐花性味苦，微寒，歸肝和大腸經(jīng)，可清肝瀉火、涼血止血，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明其具有抗氧化、止血、保護胃腸、增強免疫、抗菌等作用[8]。目前，有關(guān)土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的相關(guān)信息主要以臨床試驗為主，其作用機制方向的研究相對缺乏。本課題組采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方式，對土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的有效活性成分與作用靶點展開了分析研究，以此了解治療銀屑病的可能的作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫、軟件及在線作圖平臺 主要包含UniProt（www.uniprot.org）、GeneCards（www.GeneCardss.）、DrugBank（www.drugbank.ca）、OMIM（omim.org）、String（cn.string-db.org）、Metascape（metascape.org）等數(shù)據(jù)庫，TCMSP平臺（old.tcmsp-e.com）、Cytoscape3.7.2、微生信在線作圖平臺（www.bioinformatics.com.cn）、Venny2.1在線作圖平臺（www.liuxiaoyuyuan.cn）等工具平臺。

1.2 土茯苓-槐花活性成分及靶點信息的獲取 利用TCMSP平臺（中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺），分別將“土茯苓”“槐花”作為關(guān)鍵詞搜索，根據(jù)文獻報道以及藥代動力學(xué)參數(shù)將篩選標(biāo)準(zhǔn)制定為口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相同性（DL）≥0.18[9]，挖掘兩種藥物有效活性成分以及這些活性成分所對應(yīng)的藥物靶點信息，因為研究表明OB≥30%的化合物在口服后吸收良好，代謝緩慢，容易發(fā)揮藥效；而DL≥0.18的化合物在化學(xué)上更加適合藥物的研究與開發(fā)[10]。然后將這些靶點信息與Uniport數(shù)據(jù)庫中的“人類”靶點數(shù)據(jù)相匹配，利用UniportKB功能，進一步獲得其所對應(yīng)的基因名稱。

1.3 銀屑病相關(guān)靶點的篩選 使用“Psoriasis”為搜索關(guān)鍵詞，高關(guān)聯(lián)性為標(biāo)準(zhǔn)，分別在Genecards、DrugBank、OMIM等疾病數(shù)據(jù)庫中進行檢索篩選，并將所獲得的疾病基因合并后刪除重復(fù)值，得到疾病的相關(guān)靶點數(shù)據(jù)。

1.4 構(gòu)建藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape3.7.2軟件建立土茯苓-槐花藥對的“有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 獲取土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的潛在作用靶點 將土茯苓-槐花藥對的作用靶點與銀屑病的疾病靶點數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Venny2.1在線作圖平臺，獲取其交集靶點，即為土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的潛在作用靶點。

1.6 建立蛋白質(zhì)相互作用系絡(luò)圖（PPI） 將獲取的土茯苓-槐花藥對與銀屑病的交集靶點上傳進String數(shù)據(jù)庫中，利用“Multiple Proteins”進行蛋白質(zhì)相互作用分析，把物種限定為“人類”（Homo sapiens），提交后進行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的建立，之后將已建立好的PPI圖數(shù)據(jù)下載并輸入Cytoscape3.7.2軟件中進行可視化處理，以各靶點基因之間的節(jié)點度值（degree）為排列指標(biāo)，選擇PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的主要蛋白質(zhì)，并利用作圖工具繪制degree值排前20靶點的水平柱狀圖。

1.7 構(gòu)建GO功能富集分析和KEGG通路分析 將藥物與疾病的交集靶點信息輸入至Metascape平臺后進行KEGG以及GO分析，下載其結(jié)果并利用微生信在線作圖平臺進行可視化處理，以研究土茯苓-槐花藥對治療銀屑病所相關(guān)的生物學(xué)進程。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓-槐花藥對活性成分與其作用靶點的篩選 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別將土茯苓、槐花為搜索詞獲取兩種中藥的有效活性成分，通過篩選標(biāo)準(zhǔn)OB≥30%，DL≥0.18，共獲取21個有效活性成分，其中土茯苓15個，槐花6個，合并去除重復(fù)值后得到19個活性成分，見表1。然后再次使用TCMSP平臺，搜索出這19個活性成分相對應(yīng)的作用靶點信息，合并去重后一共獲得227個靶點信息，將最終的靶點信息利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進一步轉(zhuǎn)換為基因名（Gene name）。

表1 土茯苓-槐花藥對有效成分信息表

2.2 銀屑病相關(guān)靶點的篩選結(jié)果 使用“Psoriasis”為搜索關(guān)鍵詞，高關(guān)聯(lián)性為標(biāo)準(zhǔn)，分別在Genecards、DrugBank、OMIM等疾病數(shù)據(jù)庫中進行檢索篩選，得到銀屑病靶點個數(shù)分別為4 054（根據(jù)Genecards中銀屑病靶點的相關(guān)性評分，以二倍中位數(shù)的方法篩選后得到銀屑病較為相關(guān)的靶點為1 676個[11]）、83、133，篩選后的結(jié)果合并且去除重復(fù)值后獲得1 790個靶點信息。

2.3 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的建立與分析 使用Cytoscape3.7.2軟件繪制與分析土茯苓-槐花藥對的有效活性成分以及作用靶點信息的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，共獲得248個節(jié)點和433條關(guān)系，見圖1。

圖1 土茯苓、槐花藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的潛在作用靶點將土茯苓-槐花藥對的227個作用靶點與銀屑病經(jīng)篩選合并去重后的1 790個疾病靶點數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Venny2.1在線作圖平臺制作韋恩圖，得到土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的潛在作用靶點119個，見圖2。

圖2 土茯苓-槐花治療銀屑病靶點的韋恩圖

2.5 土茯苓-槐花藥對治療銀屑病關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 把119個交集靶點輸入String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定條件后進行蛋白質(zhì)相互作用分析，從而建立出基礎(chǔ)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，然后將建立好的PPI圖數(shù)據(jù)下載并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，圖中包括119個節(jié)點，2 195條邊，節(jié)點大小與顏色程度反映靶點的度值（Degree）值大小，節(jié)點越大Degree值也越大，代表顏色從淺到深的Degree數(shù)值也相應(yīng)增加，見圖3。以各靶點基因之間的節(jié)點連接Degree值為排列指標(biāo)，選擇出PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的主要核心蛋白質(zhì)，并利用繪圖工具繪制Degree值排前20靶點的水平柱狀圖，見圖4。

圖3 土茯苓-槐花與銀屑病蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 土茯苓-槐花藥對治療銀屑病通路富集分析可視化 使用Metascape數(shù)據(jù)庫對119個關(guān)鍵信息節(jié)點進行富集分析，其中包括GO功能富集分析的MF（Molecular Function）、BP（Biological Process）、CC（Cellular Component）和KEGG通路分析，然后保存其所得到的結(jié)果。依據(jù)Log10（P）值的大小，把前20的數(shù)據(jù)進行可視化處理，把GO分析的MF、BP、CC的結(jié)果做成水平柱狀圖，顏色由紅色漸變?yōu)樗{色，表示Log10（P）值由小變大，主要節(jié)點的數(shù)量由橫軸表示，見圖5。把KEGG通路結(jié)果通過微生信在線作圖平臺用氣泡圖呈現(xiàn)，圖中由紅色漸變?yōu)榫G色說明Log10（P）值由小變大，氣泡大小表示此通路富集的基因數(shù)量，通路富集基因數(shù)量在所有基因中所占比率在橫軸表示，見圖6。

圖5 土茯苓-槐花藥對治療銀屑病作用靶點富集條形圖

圖6 土茯苓-槐花作用靶點的KEGG富集分析通路圖

3 討論

藥對是中醫(yī)學(xué)臨床治療常配伍使用的兩味藥物，由于藥物配伍后有效活性成分相互作用，使其藥物物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變，從而進入人體后在多個靶點經(jīng)過不同的通路發(fā)生協(xié)同作用而起到增強藥物療效的作用[12]。雖然藥對具有多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)作用的優(yōu)勢，但由于中藥復(fù)雜的成分、物質(zhì)基礎(chǔ)不明確以及作用機制尚不清楚，如其毒副作用，導(dǎo)致我們無法確定具體有效活性成分，如目標(biāo)間的相互作用等問題就給中醫(yī)學(xué)治療疾病帶來了一點程度的不確定性[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)方面解釋中藥對身體產(chǎn)生調(diào)控作用的一門學(xué)科，連接了現(xiàn)代藥理學(xué)與傳統(tǒng)中藥之間的關(guān)系[14]。中藥復(fù)方以及藥對的多成分、多基因、多通路的復(fù)雜性更適合應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思維去研究。此研究方法為復(fù)方或者藥對的研究提供了大量的靶點、疾病、化合物等信息，可以從現(xiàn)代藥理學(xué)方面對以往傳統(tǒng)中藥方劑的作用機制進行研究分析，極大地為中藥新藥、新劑型的創(chuàng)造提供思路，也為中醫(yī)精準(zhǔn)治療疾病提供了數(shù)據(jù)支持[15]。因此，將中藥與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合具有重要的意義。

銀屑病是一種丘疹鱗屑型皮膚病，現(xiàn)在此病被認為是最典型的免疫介導(dǎo)的疾病之一。樹突狀細胞（DC）、抗菌肽（AMPs）、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-17、IL-22、IL-23、Th17以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3與其發(fā)病機制有很大關(guān)系[16]。中醫(yī)學(xué)對銀屑病的認知甚遠，目前大多數(shù)醫(yī)者認為有關(guān)本病最早出現(xiàn)在隋代《諸病源候論》中“干癬，但有匡郭，枯索，癢，搔之白屑出是也”[17]，后經(jīng)各個朝代不同醫(yī)者對此疾病不斷探索，對近代銀屑病的辨證論治產(chǎn)生了巨大影響。近現(xiàn)代醫(yī)者在辨證此疾病的時候幾乎均以血分論治為主，血熱、血燥、血瘀為其基本證型，在治療中不離開血分也成了各個醫(yī)者的基本思路，如朱仁康[18]、趙炳南等[19]近代名老中醫(yī)認為血熱是本病發(fā)病的主要根源。在現(xiàn)代臨床治療此病時還發(fā)現(xiàn)濕邪常與血熱夾雜[20]，所以在治療上常用清熱涼血、除濕解毒。土茯苓-槐花藥對是中醫(yī)皮膚科常用藥對，具有除濕清熱解毒的功用，來源于土槐飲，是中醫(yī)學(xué)治療銀屑病的要藥[21]。耿愛愛等[22]用土槐飲加減治療血熱型銀屑病，其中對照組與觀察組各50例患者，結(jié)果觀察組總有效率為96%，明顯高于對照組84%，說明土槐飲在臨床治療血熱型銀屑病有很好的療效。

3.1 藥物有效活性成分分析 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，一共得到土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的有效活性成分19個，227個作用靶點。由表1和圖1可知，土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的主要活性成分可能為：槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、異鼠李素以及豆甾醇等。槲皮素是類黃酮的一個特殊子類，是一種強大的抗氧化劑，土茯苓和槐花藥物中都含有該成分，研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用[23]。槲皮素發(fā)揮強大的抗炎作用，主要是經(jīng)過抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生，減少環(huán)氧化酶和脂氧合酶的表達，以及維持肥大細胞的穩(wěn)定性，槲皮素不但可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促進炎癥物質(zhì)，還能加快IL-10等抵抗炎癥物質(zhì)的分泌，從而達到對銀屑病的治療效果[24]。山柰酚作為一種多酚，廣泛存在于瓜果蔬菜以及中藥植物中。其主要通過抑制DNA和髓樣分化因子88的NF-κB結(jié)合的生物活性，從而來減少IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的釋放，增加Nrf2調(diào)節(jié)基因的mRNA和蛋白表達，抑制toll樣受體4（TLR4）來發(fā)揮強大的抗炎作用，還可抑制環(huán)氧化酶，防止炎癥過程[25]。β-谷甾醇具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性等。其通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子、抑制淋巴細胞活化和增殖而起到抗炎與免疫調(diào)節(jié)的作用[26]。柚皮素通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生，其中包含經(jīng)過制約NF-κB信號通路減低促炎細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，以及通過促進溶酶體介導(dǎo)的細胞因子降解，抑制細胞因子釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)[27]。藥理研究表明抑制NF-κB通路是異鼠李素的主要抗炎機制，炎癥反應(yīng)各個環(huán)節(jié)的很多物質(zhì)都經(jīng)NF-κB調(diào)節(jié)，包括TNF-α、多種IL、iNOS、COX2、趨化和集落刺激因子以及黏附分子等。異鼠李素也可能是一種有效的免疫抑制劑，它可以抑制樹突細胞的活化和運輸，從而減少炎癥反應(yīng)[28]。豆甾醇被廣泛地認為是一個具有免疫調(diào)節(jié)功能的天然類固醇，它還具有抗炎的作用，通過制約免疫球蛋白E（IgE）所導(dǎo)致的皮膚過敏反應(yīng)，來降低炎性細胞的浸潤以及皮損的增厚，對治療銀屑病有很大的作用[29]。

3.2 關(guān)鍵靶點結(jié)果分析 土茯苓-槐花藥對與銀屑病共有119個潛在關(guān)鍵靶點，依據(jù)Degree值的大小進行排名，其中較為重要的靶點分別為：TNF、IL-6、腫瘤蛋白P53（TP53）、IL-1β、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）等。TNF是幾種慢性炎性疾病（包括銀屑病和與銀屑病相關(guān)的其他共病）發(fā)病機制中的關(guān)鍵細胞因子，其可以活化角質(zhì)形成細胞從而產(chǎn)生其他炎性介質(zhì)。而且，血清或血漿中TNF-α水平升高被認為是銀屑病的生物標(biāo)志物，所以，它被廣泛認為是抗銀屑病治療的重要靶點[30]。IL-6在銀屑病患者中主要由內(nèi)皮細胞以及樹突狀細胞產(chǎn)生，它促進銀屑病發(fā)生發(fā)展的機制主要是通過導(dǎo)致具有免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T細胞丟失，從而影響Th17細胞與Treg細胞的平衡狀態(tài)實現(xiàn)的[31]。IL-1β可以刺激角質(zhì)形成細胞分泌趨化因子，從而化學(xué)吸引更多能夠從外周產(chǎn)生細胞的IL-17，建立起擴增的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致銀屑病等皮膚炎癥發(fā)病[32]。VEGFA是主要的促血管生成因子，在銀屑病患者皮膚中過表達，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。VEGFA在銀屑病中的作用是通過VEGFA基因組位于銀屑病易感位點之一PSORS1附近以及VEGFA單核苷酸多態(tài)性與銀屑病嚴(yán)重程度的相關(guān)性得到的[33]。

3.3 通路與生物進程分析 對土茯苓-槐花與銀屑病的共同靶點信息進行KEGG通路富集分析，土茯苓-槐花藥對治療銀屑病主要涉及以下幾條通路：PI3KAkt、AGE-RAGE、MAPK、IL-17、TNF等信號通路。根據(jù)研究表明，PI3K-Akt信號通路是細胞生長、增殖、存活、細胞凋亡抑制、脂肪生成抑制等過程中至關(guān)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對于皮膚而言，該信號通路對角質(zhì)形成細胞、真皮纖維細胞、毛囊干細胞等的存活、生長、增殖、再生和凋亡至關(guān)重要，并且能維護它們的功能[34]。PI3K-Akt-mTOR途徑在銀屑病患者皮損中高度表達，銀屑病患者體內(nèi)PI3K與Akt結(jié)合，從而反過來激活mTOR以促進角質(zhì)細胞過度增殖并抑制分化。據(jù)報道，細胞因子和生長因子如IL-17和IL-12的失調(diào)可激活mTOR途徑，這是調(diào)節(jié)銀屑病增生和炎癥過程的必要因素。據(jù)報道PI3K-Akt-mTOR信號通路在Th1/Th2/Th17失衡中起作用，這是銀屑病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵，因此PI3K-Akt信號通路被認為是銀屑病的發(fā)病機制，有望成為一個有前途的抗銀屑病靶點[35]。據(jù)研究表明，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路可能是導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的機制之一，銀屑病體內(nèi)炎性因子的升高，會引起機體代謝異常、胰島素抵抗等各種進程，因此通過抑制該通路便可抑制炎性因子的產(chǎn)生，從而起到治療銀屑病的作用[36]。有研究表明，MAPK信號通路的過度激活對銀屑病患者體內(nèi)炎性因子的產(chǎn)生有著促進作用[37]。T細胞來源的IL-17可以激活多種細胞，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞，釋放細胞因子和趨化因子，促進炎癥，IL-17途徑的失調(diào)使自身免疫性和炎癥性疾病中的慢性炎癥持續(xù)存在，如銀屑病。銀屑病被認為是在遺傳易感個體對特定自身抗原失去T細胞耐受性時引發(fā)的。這可能發(fā)生在環(huán)境損傷激活先天免疫細胞的情況下。例如，當(dāng)與抗微生物肽LL-37復(fù)合時，受損細胞釋放的DNA通過TLR-9激活漿細胞樣樹突細胞（pDC）產(chǎn)生IFN-α，并允許DC向T細胞呈遞LL-37自身抗原.然后這些T細胞在特異性極化細胞因子的影響下分化成Th1和Th17細胞亞群。Th17細胞產(chǎn)生IL-17A、IL-17F和IL-22，它們單獨或與TNF一起有效激活角質(zhì)形成細胞。這些角質(zhì)細胞然后分泌抗微生物肽、細胞因子和趨化因子，招募和激活免疫細胞，導(dǎo)致持續(xù)炎癥的反饋循環(huán)，因此抗IL-17療法在銀屑病中的治療中有很重要的作用[38]。研究表明，TNF是一種關(guān)鍵的促炎和免疫調(diào)節(jié)細胞因子，其失調(diào)與自身免疫性疾病和其他病理的發(fā)展有關(guān)，TNF-α信號通路是導(dǎo)致銀屑病發(fā)生發(fā)展的主要通路之一，而且在治療銀屑病患者時使用抗TNF-α的生物制劑也得到了良好的效果[39]。

綜上所述，本研究經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了土茯苓-槐花藥對治療銀屑病的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、異鼠李素、豆甾醇等，而發(fā)生作用的重要信號通路可能有PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK、IL-17、TNF等。這也反映了土茯苓-槐花藥對治療銀屑病是通過多個活性成分、多種作用靶點、多種通道的化學(xué)過程進行的，這為更加明確土茯苓-槐花藥對對治療銀屑病的作用機制奠定了理論學(xué)習(xí)基礎(chǔ)。但鑒于本研究的局限，將來應(yīng)經(jīng)過更多的實驗和數(shù)據(jù)來證實土茯苓-槐花治療銀屑病的重要靶點信息及信號通路。