參芪益心方對心力衰竭大鼠心功能及其心肌細胞凋亡率的影響*

陳 鵬 李嘉寧 劉 莉 崔 璇

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

心力衰竭常常由于心室泵送血液或充盈功能過低，心血排出量無法滿足人體的新陳代謝要求，流向組織和臟器間的血液不足所致，是心臟的各種病變進展到嚴重階段時的一種臨床綜合征[1-2]。隨著人口增加、人口老齡化和各種并發癥的增加，心力衰竭患者數量預計將在未來大幅上升[3]。研究發現，心力衰竭發生發展常常與心肌細胞代謝障礙、心肌重構密切相關[4]。西醫治療上結合中醫辨證療法可以有效改善心力衰竭患者的臨床癥狀，提高生活質量[5]。參芪益心方是我院劉莉教授的經驗方，具有理氣、溫陽、活血、利水之效，療效較佳[6]。以往研究發現參芪益心方可以有效地改善心肌細胞的功能[7]。在本研究中，我們將參芪益心方用于阿霉素腹腔注射誘導的心力衰竭模型[8]，并追蹤其對大鼠心功能和心肌細胞凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只Wistar大鼠，雄性，購自長春市億新實驗動物公司，體質量（200±20）g，生產許可證：SCXK-（吉）2011-0004；使用許可證號：SYXK-（黑）2008-007。常溫房間飼養，自由飲食、飲水。

1.2 藥物與試劑 參芪益心方由太子參、黃芪各20 g，赤芍、茯苓、丹參、五味子、麥門冬、五加皮、葶藶子各15 g，桂枝、炙甘草各10 g組成。飲片由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供，加水濃煎后分別制成含量為1.696 g/mL和3.392 g/mL的水煎劑備用?？ňS地洛（齊魯制藥有限公司，國藥準字H20020535，規格6.25 mg/片），用滅菌注射用水配成0.558 mg/kg溶液備用。阿霉素（浙江海正藥業，國藥準字H44024359，規格10 mg/瓶），用滅菌注射用水配成0.8 mg/mL溶液備用。芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業，國藥準字Z20040141，規格0.3 g/粒），用滅菌注射用水配成0.3214 g/kg溶液備用。PBS緩沖液（杭州四季青生物生產，生產批號：020311）。

1.3 實驗儀器 細胞凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司），電熱恒溫箱（上海一恒），2135型輪轉式組織切片機（德國萊卡公司），BX60光學顯微鏡（OLYMPUS，日本）病理圖像分析系統（CIMAS Med 6.0，麥克奧迪圖像技術有限公司）。

1.4 分組與造模 大鼠喂養1周后隨機分為6組，每組15只，即正常對照組、模型組、西藥對照組、芪藶強心組、參芪益心方低劑量組、參芪益心方高劑量組。參考文獻[8]，除正常對照組外，其余各組于造模的第1、3、5周，用配制好的阿霉素溶液以3 mg/mL給藥，第2、4、6周以2 mg/mL的劑量給藥。正常對照組腹腔注射等容積的生理鹽水。每周1次，共注射6周。

1.5 給藥方法 造模成功后，正常對照組大鼠自由飲食、飲水，模型組大鼠注射10 mL/kg生理鹽水，西藥對照組注射0.558 mg/kg卡維地洛，芪藶強心組灌服0.3214 g/kg的芪藶強心膠囊混懸液，參芪益心方低劑量組灌服1.696 g/mL的參芪益心方煎劑，參芪益心方高劑量組灌服3.392 g/mL的參芪益心方煎劑，每日1次，共4周。

1.6 心功能檢測 各組大鼠在灌胃結束后4周后進行超聲心動圖。腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，胸部備皮，選用10 MHz射頻探頭，與胸骨呈20～30°，顯示沿二尖瓣口至心尖方向的左心室長軸切面。B超獲取胸骨旁左心室長軸的二維圖形，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M超，用M超確定左心室舒張末期內徑（LVDD）和收縮末期的內徑（LVSD），并用Teichholtz公式計算射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）。每個數據集取連續3個心動周期的平均數。

1.7 標本采集與檢測 1）心臟組織形態學。采用頸椎脫臼法處死大鼠，修塊組織后清洗掉固定液，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，常規切片后裱于涂有聚賴氨酸的載玻片上，4℃存放備用。切片經HE染色后用中性樹膠膠印封片，光學顯微鏡下觀察海馬組織病理變化并攝片。2）細胞凋亡率檢測。石蠟切片常規脫蠟至水，滴加胃蛋白酶K，室溫下孵育30 min，PBS沖洗2次；擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的Tunel反應混合液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗3次；擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的轉化劑POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；滴加顯色劑DAB，室溫下10 min，蒸餾水充分沖洗；蘇木素復染1 min；常規脫水透明，中性樹膠封片。用CMIAS對細胞凋亡切片進行分析，觀察心肌細胞凋亡密度。在200倍顯微鏡下，每個切片隨機選擇5個視野并將圖像輸入計算機，選擇1個細胞凋亡模塊，用灰度對比調整方法計算視野內的染色細胞面積。然后把已凋亡細胞的總面積與統計領域的總面積之比（即表面密度）作為統計數字，取平均值進行數據分析。

1.8 統計學處理 應用SPSS26.0統計軟件。計量資料以（）表示，計量資料和計數資料分別采用t檢驗和χ2檢驗，所有統計采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠的LVSD、LVDD均增加，FS、EF均有顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；各治療組與模型組對比，各指標都有顯著改善，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；參芪益心方低劑量組與西藥對照組、芪藶強心組比較，各指標都有顯著改善，差異有統計學意義（P＜0.01）。參芪益心方高劑量組與低劑量組比較，LVSD、LVDD無差異，FS、EF有改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥對照組比較，△△P＜0.01；與芪藶強心組比較，##P＜0.01；與參芪益心方低劑量組比較，▲P＜0.05。下同。

組別正常對照組模型組西藥對照組芪藶強心組參芪益心方低劑量組參芪益心方高劑量組n 15 10 13 12 11 13 LVSD（mm）3.736±0.297**5.154±0.455 4.315±0.195**4.313±0.186**4.836±0.166*△△##4.328±0.159**LVDD（mm）5.102±0.236**6.731±0.333 5.917±0.182**5.798±0.156**6.319±0.256*△△##5.695±0.162**FS（%）48.279±1.990**22.229±2.097 41.530±2.481**41.620±2.313**28.020±2.506*△△##42.495±1.725**▲EF（%）83.741±2.372**44.701±3.740 76.530±3.191**74.919±3.290**52.502±4.671*△△##73.790±2.301**▲

2.2 各組大鼠心肌病理變化 正常對照組：心肌纖維成束排列，結構均勻，心肌間質無腫脹或充血，無炎細胞浸潤。模型組：心肌纖維損傷、變性和壞死，間質血管擴張和充血，炎細胞浸潤和心肌成纖維細胞增殖。西醫對照組：心肌纖維輕微腫脹，少數纖維腫脹或破裂，間質血管擴張和充血，少量炎細胞發生浸潤。芪藶強心組：心肌纖維腫脹，部分心肌組織萎縮，間質血管擴張充血，炎細胞浸潤。參芪益心方低劑量組：心肌纖維充血和腫脹，有散在的炎細胞浸潤。參芪益心方高劑量組：心肌纖維呈束狀，輕微腫脹，有少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況 正常對照組：大腦偶見凋亡細胞。模型組：凋亡細胞數目比正常對照組明顯增多。西醫對照組：凋亡細胞數目比模型組明顯減少。芪藶強心組：可見凋亡細胞，但數目比模型組減少。參芪益心方低劑量組：可見凋亡細胞，但數目比模型組減少。參芪益心方高劑量組：凋亡細胞數目比模型組明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡觀察（電鏡，11 500倍）

模型組凋亡細胞的表面密度與正常對照組相比較大，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組調節細胞的表面密度明顯降低（P＜0.01）。各治療組之間比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠細胞凋亡面密度（±s）

表2 各組大鼠細胞凋亡面密度（±s）

組 別n 面密度正常對照組模型組西藥對照組芪藶強心組參芪益心方低劑量組參芪益心方高劑量組15 10 13 12 11 13 0.0668±0.0098**0.1130±0.0122 0.0777±0.0066**0.0809±0.0113**0.0813±0.0114**0.0740±0.0082**

3 討論

研究表明，細胞凋亡是心血管疾病中介導的一種新的細胞死亡形式，多涉及幾個關鍵分子，如RIPK1、RIPK3和MLKL[9]。心肌細胞在心力衰竭的早期出現與演變發展中起了關鍵性的作用，大量人體心肌細胞凋亡或（和）纖維化是心力衰竭時細胞功能異常的主要原因[10]。細胞凋亡引起心室重塑[11]，心室重塑與心肌細胞的超微結構變化密切相關。在心肌細胞中，心臟重構進行收縮運動時最基本的結構單元是肌絲，而肌絲超微構造的改變也會影響整體的收縮運動功能。線粒體是心肌細胞能量代謝的基礎場所，其形態和結構變化在一定程度上反映了心功能的下降與否。成功建立心衰動物模型是研究心衰的重要一步。大鼠價格便宜，易于飼養，耐受性好，心臟的解剖學和生理學與人類相似。歐洲心臟病學會常依據心功能水平高低來評定心力衰竭的程度[12]；超聲心動圖可以準確評估心腔的大小和心室功能，逐漸應用于心血管疾病的小動物模型研究[13]。故本研究主要通過B超評估心力衰竭大鼠的心功能，并通過公式來估算EF和FS。

中醫首次提到“心衰”一詞源于《黃帝內經》“心氣始衰，苦憂悲……故好臥”。通過歷代不同專家的探討，心衰原因大多歸于本虛標實，本是心臟缺少陽氣，標是血液瘀滯、水液和痰水潴留[14]。氣為血之帥，故氣既可生血，也能行血，因心氣不足故血瘀脈道；氣虛之極為陽虛，長期氣虛會導致陽氣不足，血液失于溫煦，亦可滯于脈中。氣既可生津，又可行津，氣虛則無法運化水液，氣不行水，從而導致水液與痰液停滯。

我院劉莉教授在理氣、溫陽、活血、利水基礎上研究出參芪益心方[7]。筆者以參芪益心方加味，取其大補心陽且活血化痰之功，基本組成包括太子參、黃芪、桂枝、茯苓、赤芍、丹參、五味子、麥門冬、五加皮、葶藶子、炙甘草。方中君藥為太子參與黃芪，補中益氣，振奮心陽，令瘀血、水飲之邪去；《本草綱目》“丹參……能破宿血也”，丹參、赤芍合用祛瘀通絡利水；五加皮利水勝濕消腫；五味子益氣生津；葶藶子利水平喘。諸藥合用使心陽得溫，陽氣得充，瘀血得行，經脈得通，諸癥得解。

現代臨床研究發現參芪益心方在治療心力衰竭療效顯著。藥理研究結果表明太子參可以改善心肌組織的氧化應激，改善NOS-NO系統，減少心肌細胞的凋亡[15]。黃芪的藥理作用與它對細胞內信號的影響有關，通過減少信號通路的激活來減弱細胞凋亡，并恢復左心室的收縮和舒張功能[16]。茯苓可以明顯減低炎癥因子的表達水平，如hs-CRP、TNF-α和IL-6，故可抑制炎癥反應，抵抗神經內分泌系統的過度興奮，進一步逆轉了心室重構，黃芪和茯苓的組合可以修復心肌損傷[17]。經吳繁等[18]研究發現，參芪益心方可以有效抑制心肌細胞凋亡，逆轉衰竭心肌能量底物的代謝重構，保護心肌細胞。

本研究結果證明參芪益心方可以有效改善心衰大鼠心臟功能、病理變化和細胞凋亡率，為進一步研究和開發抗心衰的有效藥物奠定實驗基礎。