重癥肌無力生物信息學靶點篩選及驗證

鐘斯然 張帆 夏星 李寶銅 彭詩鋼 溫玉琴 丘芬

(廣西中醫藥大學 1藥學院,廣西 南寧 530299;2中藥藥理重點實驗室)

重癥肌無力(MG)主要指的是由乙酰膽堿受體抗體介導的自身免疫疾病。其發病原理乙酰膽堿能運動神經元與肌肉的突觸產生病變〔1，2〕。臨床表現是波動性四肢骨骼肌疲勞〔3〕，并可累及咽喉肌或眼外肌，表現為眼瞼下垂、視力模糊、表情淡漠、抬頭飲水困難、聳肩無力、上樓梯、下蹲及抬臂困難等，據估計，MG患者75%以上有胸腺增生，嚴重影響患者的正常生活和身體健康。由于MG的發病原因不明，目前尚無特效療法。

生物信息學是以計算機為工具，對生命科學研究中的生物信息進行存儲、檢索和分析的科學。這門新學科開辟了疾病研究的新途徑。本文通過探討MG相關的mRNAs表達的改變，為MG的診斷和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1數據收集預處理和差異表達分析 胸腺基因芯片原始數據收集于GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)，芯片數據的編號為GSE11967，芯片平臺為GPL5175 〔HuEx-1_0-st〕 Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array 〔transcript (gene) version〕。芯片的樣本來源于MG患者胸腺和正常胸腺，分為對照組和MG組各2例。下載的原始數據通過R語言Affy程序包〔4〕進行數據預處理，包括扣除背景，標準化數據，標注探針，構建表達矩陣；通過主成分分析(PCA)和t-分布域嵌入算法(t-sne)的質控分析，探討各組間和組內的異質性和同質性，并進行質控和分析。最后，使用limma〔5〕程序包分析正常樣本和MG樣本mRNA表達差異。同時繪制火山圖和熱圖，過濾探針注釋信息不全，極低表達和重復的基因，其中差異mRNA的篩選條件為FDR<0.01，LogFC >|2|。

1.2基因功能與信號通路的富集分析 基因本體數據庫(Gene ontology，GO，http：//geneontology.org/)〔6〕是一個在生物信息學領域中廣泛使用的基因注釋數據庫，提供一系列的語義用來描述基因、基因產物的特性。京都基因與基因組百科全書(KEGG，https：//www.kegg.jp/)〔7〕是大型分子數據集產成的基因組測序等高通量實驗技術應用的數據庫資源。

使用R語言clusterProfiler程序包〔8～10〕和相關的捆綁數據軟件包，選取差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。通過繪制基因富集功能網絡圖探究：哪些富集的功能或通路與哪些基因相關；哪些基因同時參與哪個生物學功能或途徑；富集的功能或途徑之間有什么關系。

1.3蛋白質相互作用(PPI)網絡分析 STRING數據庫〔11〕(https：//string-db.org/)，選取差異表達基因，獲取蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)信息，對胸腺差異表達基因構建蛋白質相互作用網絡。通過Cytoscape軟件及插件MCEODE、cytohubba，對網絡拓撲分析，篩選網絡中核心基因。

1.4核心基因的驗證

1.4.1動物 C57BL/6小鼠，SPF級，雌性，體重18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK(湘)2016-0002，實驗動物質量合格證號：43004700046105。

1.4.2試劑 人工合成鼠源性乙酰膽堿α亞基97-116 肽(Rα97-116)購自吉爾生化(上海)有限公司，批號P180509-DG148487；不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)購自Sigma，批號分別為SLBV6904、SLBW1457；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Biological Industries，批號0012918；小鼠抗乙酰膽堿脂酶受體抗體(AchR-Ab)試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，批號2018-9。

1.4.3儀器 UW620H型 電子天平(感量：0.01 g)，日本Shimadzu公司；TGL-20M型低溫高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HVA-110型高壓滅菌器，日本Hirayama公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Infinite200pro型酶標儀，Tecan奧地利有限公司。

1.4.4造模 取87只C57BL/6小鼠，12只作為空白組，其余小鼠復制MG模型作為模型組〔12〕。首次免疫于小鼠雙肩及雙后足底部共4個部位皮下注射50 μl/部位，正常組注射生理鹽水，其余小鼠注射Rα97-116/CFA混合液(Rα97-116：PBS液：CFA=1 mg∶2 ml∶2 ml)；首次免疫后第30天和第50天，采用同一配比的Rα97-116/IFA混合液于上述4個部位注射50 μl/酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定部位強化免疫。末次免疫后20 d，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血0.3 ml，3 000 r/min分離血清，測定血清AChR-Ab水平，(樣品血清OD值/空白組血清OD值>2.1視為AChR-Ab陽性)。

1.4.5模型篩選

1.4.5.1行為學觀察 采用lennon分級〔13〕，分為4級：0級，無肌無力表現；1級，撕咬無力，小鼠運動減少；2級，明顯無力，低頭垂尾，協調性下降；3級，肌無力表現嚴重瀕臨死亡；4級，死亡。癥狀兩者之間為0.5、1.5、2.5、3.5分，評分≥1分為造模成功。

1.4.5.2新斯的明實驗 每只小鼠注射適量新斯的明和阿托品〔14〕，如果癥狀改善維持一段時間，評分降低證明該小鼠新斯的明實驗陽性。

1.4.5.3RNS電刺激實驗 BL420系統觀察腓腸肌肌電波幅有無衰減〔15〕，第4個波幅比第1個衰減率>10%為陽性,>20%為強陽性。同時滿足AChR-Ab陽性，即P/N值>2.1，P/N=(供試樣品OD值-空白孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白孔OD值)、肌力癥狀學評分≥1分、新斯的明實驗陽性、RNS電刺激第4個波幅比第1個衰減率>10%，則表明造模成功。

1.4.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測核心基因表達 末次藥后，禁食不禁水12～16 h，眼眶后靜脈叢取血，3 000 r/min分離血清，取胸腺-80℃凍存，RT-qPCR檢測CCL19、BGN基因表達。

2 結 果

2.1樣本數據的降維分析 使用PCA和t-sne對GSE11967表達矩陣在樣本的維度進行降維及可視化分析，圖1中一個點代表一個樣本，該樣本組內差異很小，組間差異較大，兩種樣本的基因表達異質性較大。表明芯片數據質量較好，可以用于下游分析。

圖1 GSE11967樣本的PCA降維分析、t-sne降維分析

2.2MG差異表達mRNA篩選和富集分析 對芯片數據用limma進行差異分析后，篩選出85個差異表達基因，利用R繪制火山圖和熱圖后發現33個上調，52個下調。見圖2和圖3。

2.3GO和KEGG富集分析 圖4可以看出BGN、CTGF等基因富集于細胞外基質組織、分支上皮的形態發生通路。圖5可以看出CX3CR1、CXCLL11、CCL19基因與細胞因子-細胞因子受體相互用相關。CX3CR1、CXCL11、CCL19基因與病毒蛋白質和細胞活素-細胞活素受體相互作用相關。

圖2 差異mRNA表達火山圖

圖3 差異mRNA表達熱圖

圖4 GO富集分析及GO功能與富集基因的聯系(網絡連線的顏色代表GO分析)

2.4PPI網絡分析 通過Cytoscape及其插件對PPI網絡進行拓撲分析，首先對胸腺組織差異表達基因構建PPI網絡，使用MCODE篩選核心的子網絡，其中發現CXCL11、CCL19、CHRM4、CX3CR1、HCAR1構成子網絡。見圖6。使用CytoHubba進行網絡拓撲分析，MCC前十個基因包括BGN、CCL19、CTGF、COL1A2、 FBLN1、CDH11、CXCL11、HCAR1、CHRM4、CX3CR1。

圖6 差異表達基因構建PPI網絡MCODE score(顏色由深到淺表明評分高到低)

2.5動物實驗驗證結果

2.5.1模型篩選 空白組lennon評分〔(2.1±0.55)分〕顯著高于模型組〔(0.0±0.00)分，P<0.01〕；空白組Achr-Ab水平〔(123.49±23.74)pg/ml〕顯著低于模型組〔(373.40±69.19)pg/ml，P<0.01〕；模型組新斯的明給藥后小鼠癥狀評分〔(1.5±0.58)分〕顯著低于給藥前〔(2.1±0.58)分，P<0.01〕。肌電圖顯示模型組第4個波幅比第1個波幅下降率>10%，表示造模成功。見圖7。

2.5.2BGN、CCL19在小鼠胸腺中表達 與空白組比較，模型組BGN表達水平顯著上調，而CCL19表達水平顯著下調(P<0.05)。見表1。

圖7 兩組肌電圖

表1 RT-qPCR檢測BGN、CCL19表達

3 討 論

BGN是富含小分子亮氨酸的蛋白聚糖(SLRPs) 家族成員之一，由2條糖胺聚糖側鏈和一個核心蛋白組成。其核心蛋白分子量約42 kD，含12個亮氨酸重復單位。BGN廣泛分布在骨、軟骨、肌腱、纖維組織等多種細胞外基質組織中，是細胞外基質的重要成分，現已被證明是參與炎癥反應的關鍵分子。在急性和慢性炎癥中，BGN均能促進白細胞介素(IL)-1β的分泌〔16〕。研究表明，隨著炎癥的增強，BGN高表達并伴隨著嚴重的組織損傷。而且，無論是在病原體誘導〔17〕還是無菌條件下BGN的缺乏均能減少炎癥反應〔18〕。

趨化因子是一組小分子量的蛋白質家族成員，可以調控白細胞在炎癥部位募集，并且具有穩定淋巴細胞環境的功能，趨化因子CCL19可能在正常淋巴細胞循環和歸巢中發揮作用。它在胸腺T細胞的運輸，T細胞和B細胞向次級淋巴器官的遷移中也起著重要作用。