靈芝酸A 通過激活Nrf2/GPX4 信號通路減輕七氟烷誘導的HT22 細胞鐵死亡

張玉婷，謝小娟*，王彩云，張夢露

（河南科技大學第一附屬醫院/河南科技大學臨床醫學院，河南 洛陽 471003）

七氟烷是臨床上常見的揮發性麻醉藥，具有麻醉效果好、性質穩定等優點，但七氟烷可引起神經障礙，影響認知功能[1]。 麻醉相關認知障礙常發生在老年患者手術之后，這種現象稱為術后認知功能障礙，60 歲以上老年患者出現術后認知功能障礙的比例約為25%[2]。 有研究[3]發現，七氟烷能夠誘導神經細胞鐵死亡，這可能是七氟烷損傷神經的機制之一。尋找減輕七氟烷造成神經損傷的有效方法是臨床麻醉研究中的難點之一。靈芝是十分珍貴的藥用真菌，靈芝酸A（ganoderic acid A, GAA）是從靈芝中分離出來的三萜類活性成分，有解毒、鎮靜、止痛、保肝、抗腫瘤等作用[4]。 另外，GAA 還具有降低膽固醇、調節免疫等作用[5]。有研究[6]發現，GAA 可改善氯化鋰－匹魯卡品誘導的癲癇大鼠海馬神經元損傷，對癲癇神經元損傷有改善功效。 此外，GAA 可以減弱Aβ25-35 誘導的HT22 細胞活力降低、 細胞凋亡和衰老[7]。與此同時，GAA 也可以通過刺激β 腎上腺素能受體在體外保護神經細胞免受NO 誘導的應激損傷[8]。 因此，推測GAA 可能對于神經細胞具有保護作用，使其免受外界不良刺激引發的應激反應。與此同時，細胞鐵死亡與氧化應激又具有密切的聯系[9]，核轉錄因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroidrelated factor 2, Nrf2）具有抗氧化應激的作用，Nrf2可誘導谷胱甘肽過氧化物酶4（phospholipid glutathione peroxidase 4, GPX4）表達、抵抗氧化應激，進而減少鐵死亡，神經認知功能障礙與Nrf2/GPX4信號通路調控的神經元細胞鐵死亡有關[10]。 目前，對GAA 影響七氟烷誘導的神經細胞鐵死亡的作用和機制尚不清楚。本研究探討GAA 對七氟烷誘導的小鼠海馬神經元HT22 細胞鐵死亡的影響和作用機制，為七氟烷麻醉神經損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠海馬神經元HT22 細胞（CL-0697）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養液培養細胞，置于含有5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2 主要試劑和儀器

Fe2+檢測試劑盒（E1042-100），購自北京普利萊基因技術有限公司；兔抗GPX4 抗體，購自美國Gene-Tex 公司；谷胱甘肽（glutathione, GSH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000，購自美國英杰生命技術有限公司；4-羥基壬烯醛（4-hydroxy-2E-nonenal，4-HNE，批號：ab238538）檢測試劑盒，購自美國Abcam 公司；兔抗Nrf2 抗體（批號：sc-365949）， 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；兔抗酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4, 批號：22401-1-AP）抗體，購自美國Proteintech公司；兔抗溶質載體家族成員7 成員11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11，批號：A13685)抗體，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；GAA 純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；七氟烷（生產批號：201008，國藥準字H20070172），購自上海恒瑞醫藥有限公司。 細胞恒溫培養箱購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 細胞處理

參考文獻中的方法[11]，將HT22 細胞分成對照組（Control 組）、七氟烷誘導組（Sev 組）、GAA-25 μmol/L組、GAA-50 μmol/L 組、GAA-100 μmol/L 組。 Sev組、GAA-25 μmol/L 組、GAA-50 μmol/L 組、GAA-100 μmol/L 組細胞在實驗0 h 時均給予4%七氟烷處理6 h；另外，不同濃度GAA 組細胞分別添加濃度25、50、100 μmol/L 的GAA 干預。 Control 組細胞按照常規方法培養。 HT22 細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM 細胞培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.4 CCK-8 實驗檢測細胞增殖情況

HT22 細胞接種到96 孔板內，每個孔內添加3000 個細胞，分別在細胞中添加0、25、50、100、200、400、800 μmol/L 的GAA，按照“1.3”項中分組方法處理，培養48 h，在七氟烷處理后，在細胞中添加CCK-8 溶液10 μL，繼續孵育3 h。 檢測450 nm 處細胞的OD 值，計算細胞存活率。

1.5 比色法檢測Fe2+含量

HT22 細胞按照“1.3”項中分組方法處理，收集細胞，用PBS 洗滌細胞2 次，然后用Fe2+檢測試劑盒測定Fe2+含量，步驟根據試劑盒說明書操作。

1.6 Western blot 檢測Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表達

HT22 細胞按照“1.3”項中分組方法處理，收集細胞，在細胞中添加含有PMSF 的RIPA 溶液，放在冰上裂解20 min。 4 ℃、12 000×g 離心10 min，吸取上清液，經過BCA 方法檢測濃度后，在蛋白上清液中添加5×Loading Buffer，于100 ℃煮沸5 min。采用10%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，每個樣品孔中添加40 μg 蛋白樣品，在濃縮膠中采用90 V 電壓電泳，在分離膠中采用120 V 電壓電泳。 設置110 V電壓轉膜，轉膜時間為120 min。 將硝酸纖維素膜放在5%脫脂奶粉溶液中，于室溫下結合2 h。 然后將NC 膜放在稀釋后的一抗溶液（1∶1000 稀釋）內，于4 ℃反應過夜。 最后將NC 膜放在稀釋后的二抗（1∶2000 稀釋）內，在室溫下結合2 h。 ECL 方法顯色。ImageJ 掃描條帶的灰度值，設置GAPDH 作為參照，根據灰度值計算目的蛋白表達量。 目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值。

1.7 DCFH-DA 法檢測ROS 的相對含量

HT22 細胞按照“1.3”中分組方法處理，收集細胞，PBS 洗滌2 次。 添加10 μmol/L 的DCFH-DA，在37 ℃反應10 min。PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照，另外通過熒光酶標儀檢測熒光強度，根據熒光強度計算ROS 相對含量。

1.8 檢測細胞中MDA、GSH、4-HNE 水平

HT22 細胞按照“1.3”項中分組方法處理，收集細胞，用MDA 檢測試劑盒（可見分光光度法）、GSH檢測試劑盒（微量法）、4-HNE 檢測試劑盒（比色法）測定細胞中MDA、GSH、4-HNE 含量，步驟參照試劑盒說明書進行。

1.9 統計學分析

數據均利用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，所有數據資料運用“±s”表示，采用單因素方差分析對組間差異進行分析，P＜0.05 表示差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 GAA 對HT22 細胞增殖的影響

與0 μmol/L比較，200 μmol/L（P＜0.01）、400 μmol/L（P＜0.001）、800 μmol/L（P＜0.001）GAA 作用后HT22細胞的存活率下降。詳見圖1。選擇對HT22 細胞增殖活性無影響的25、50、100 μmol/L GAA 進行后續實驗研究。

圖1 不同濃度的GAA 處理后的HT22 細胞存活率

2.2 GAA 改善七氟烷誘導的HT22 細胞增殖活性降低和鐵死亡

與Control 組比較，Sev 組HT22 細胞存活率下降，Fe2+水平升高，并且細胞中ACSL4、SLC7A11 蛋白表達減少（P ＜0.001）；與Sev 組比較，GAA-25 μmol/L 組（P＜0.05）、GAA-50 μmol/L 組（P＜0.001）、GAA-100 μmol/L 組（P＜0.001）的HT22 細胞存活率升高。 與Sev 組比較，GAA-25 μmol/L 組（P＜0.01）、GAA-50 μmol/L 組（P＜0.001）、GAA-100 μmol/L 組（P＜0.001）的HT22 細胞Fe2+水平降低。 與Sev 組比較，GAA-50 μmol/L 組（P＜0.001）、GAA-100 μmol/L組（P＜0.001）的HT22 細胞中ACSL4、SLC7A11 蛋白表達增多。 詳見圖2。

圖2 GAA 對七氟烷誘導的HT22 細胞增殖和鐵死亡的影響

2.3 GAA 降低七氟烷誘導的HT22 細胞氧化應激

與Control 組比較，Sev 組HT22 細胞中ROS、MDA、4-HNE 含量升高（P＜0.001），而GSH 含量降低（P＜0.001）；與Sev 組比較，GAA-50 μmol/L 組、GAA-100 μmol/L 組的HT22 細胞中ROS、MDA、4-HNE 含量降低（P＜0.001），而GSH 含量升高（P＜0.001）。詳見圖3。

圖3 GAA 對七氟烷誘導的HT22 細胞氧化應激的影響

2.4 GAA 激活七氟烷誘導的HT22 細胞中Nrf2/GPX4 信號通路

與Control 組比較，Sev 組HT22 細胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達減少（P＜0.001）；與Sev 組比較，GAA-25 μmol/L 組（P＜0.05）、GAA-50 μmol/L 組（P＜0.001）、GAA-100 μmol/L 組（P＜0.001）的HT22 細胞中Nrf2、GPX4 信號通路。 詳見圖4。

圖4 GAA 對七氟烷誘導的HT22 細胞中Nrf2/GPX4 信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

七氟烷作為臨床十分常見的吸入性麻醉藥，其可以誘導認知損害[12]。 研究[3]表明，七氟烷處理后的神經細胞增殖活性降低，鐵死亡增多，這可能是七氟烷造成神經功能障礙的關鍵因素之一。 鐵死亡的發生常常伴隨ROS 含量增多、鐵離子水平升高、脂質過氧化異常等現象，鐵死亡是細胞死亡的方式之一，在神經系統損傷、腫瘤、腎損傷等相關疾病中存在[13]。鐵死亡時，細胞內游離了大量的Fe2+，Fe2+具有極強的氧化作用，其可以與過氧化氫作用，產生羥基自由基，誘導脂質過氧化，MDA、4-HNE 是脂質發生過氧化后的產物[14]。ACSL4 在脂肪酸代謝中發揮作用，可促進長鏈不飽和脂肪酸活化，ACSL4 缺失時，可導致長鏈不飽和脂肪酸被氧化，誘導鐵死亡[15]。 本研究顯示，七氟烷處理后的HT22 細胞增殖活性下降，細胞中Fe2+增多，ACSL4、SLC7A11 蛋白表達減少，這提示七氟烷誘導神經細胞鐵死亡，與之前的研究報道一致[15]，表明鐵死亡可能是七氟烷神經損傷的關鍵因素之一。七氟烷誘導HT22 細胞增殖活性降低和鐵死亡，而GAA 能夠提高HT22 細胞增殖活性并減少鐵死亡。 GAA 處理能夠減弱七氟烷對細胞活性和Fe2+水平的影響，并且能夠促進ACSL4、SLC7A11蛋白表達。 這些實驗結果表明GAA 可能通過抑制七氟烷神經元細胞鐵死亡發揮神經保護作用，GAA 可能是治療七氟烷麻醉造成的神經損傷的潛在藥物。

各種原因導致的過度氧化應激是神經功能損傷的主要誘因之一。 在氧化應激條件下，神經細胞內ROS 水平增加，大量的ROS 可促進細胞內膜脂質和蛋白質發生過氧化，進而導致神經元氧化損傷[16]。GSH 是人體內重要的抗氧化物，其可以清除ROS，將過氧化氫還原為H2O，修復生物膜，抵抗鐵死亡[17]。另外，GSH 耗竭還可以誘導GPX4 活性降低，而GPX4 是鐵死亡和抗氧化反應的中心調控因子，GPX4 異常被認為是細胞鐵死亡的必要條件[18]。GSH的合成受到半胱氨酸濃度影響，半胱氨酸含量不足時，能夠阻斷GSH 的合成，而SLC7A11 是半胱氨酸蛋白轉運系統的重要組成部分[19]。本研究結果顯示，七氟烷處理后的HT22 細胞ROS、MDA、4-HNE 含量升高，GSH 含量降低，表明七氟烷導致HT22 神經細胞出現氧化損傷。 同時，GAA 處理可降低細胞中ROS、MDA、4-HNE 水平，并且能夠提高GSH 含量，這說明GAA 有抗七氟烷誘導的HT22 細胞氧化應激的作用。

Nrf2 是氧化應激的關鍵調控因子，其一方面可促進GPX4 表達，一方面又可以誘導GSH 合成，進而抑制鐵死亡[20]。 Nrf2/GPX4 信號是氧化應激、鐵死亡的重要參與者[21]。 Nrf2 和GPX4 在膿毒癥相關認知障礙中發揮作用，Nrf2/GPX4 信號信號通路可能通過誘導海馬神經元細胞鐵死亡影響神經功能[10]。本實驗進一步說明，Nrf2/GPX4 信號參與七氟烷神經損傷，七氟烷神經損傷可能與Nrf2/GPX4 信號通路抑制有關。 GAA 促進Nrf2、GPX4 蛋白表達，說明GAA 可能是通過激活Nrf2/GPX4 信號通路，抑制七氟烷誘導的HT22 細胞鐵死亡， 進而發揮神經保護作用。

綜上所述，GAA 可減輕七氟烷誘導的HT22 細胞鐵死亡，作用機制與激活Nrf2/GPX4 信號通路有關，GAA 可能是改善七氟烷麻醉神經損傷的治療藥物。 本實驗結果為七氟烷麻醉神經損傷的治療提供了思路，為研究七氟烷麻醉神經損傷機制奠定了基礎。 后續將繼續探討GAA 抗七氟烷麻醉神經損傷的具體分子靶向機制。