整合素β1誘導人乳腺癌MCF-7細胞遷移侵襲及三苯氧胺耐藥*

楊錢，陳振海，胡淞，付偉杰

400000 重慶，重慶大學附屬中心醫院/重慶市急救醫療中心/重慶市第四人民醫院 普通外科

乳腺癌發病率呈逐年上升趨勢，目前已是我國乃至全球女性發病率最高的惡性腫瘤[1-2]。在絕經前雌激素受體陽性乳腺癌患者的內分泌治療中，三苯氧胺類藥物占據重要地位，如他莫昔芬(tamoxifen，TAM)，但長期應用帶來的繼發性耐藥限制了其臨床效果[3-4]。

整合素受體家族中，整合素β1(integrin β1,ITGB1) 分布于各類腫瘤細胞的表面,是介導腫瘤微環境間信號轉導最主要的細胞表面受體,通過傳遞細胞間及細胞外基質的反應,參與細胞黏附、遷移、細胞信號傳導、控制細胞增殖、分化及促使腫瘤血管生成等多種生理、病理過程[5]。多中心、大樣本隨機臨床對照試驗結果提示，ITGB1在乳腺癌TAM獲得性耐受過程中可能扮演重要角色，但尚無直接證據表明其參與乳腺癌細胞侵襲、轉移及耐藥等生物學行為[6-7]。此外，國內學者Yang等[8]研究發現,在Twist誘導的人乳腺癌MCF-7細胞上皮間質轉換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程中，ITGB1異常高表達，但ITGB1與腫瘤細胞EMT間的具體分子機制尚不清楚。越來越多的實驗證據提示EMT在乳腺癌細胞轉移及侵襲能力的增強中發揮關鍵作用[9-10]。MCF-7是乳腺癌ERα 陽性細胞系，目前，獲得性三苯氧胺耐藥的機制大多是基于MCF-7細胞系及其變體的研究[11-12]，基于此，本文選取MCF-7作為實驗對象，通過在人乳腺癌MCF-7細胞系中采用慢病毒轉染技術高表達ITGB1，探討ITGB1對乳腺癌MCF-7細胞系TAM耐藥、細胞遷移侵襲能力的影響以及分子機制，以期為后續逆轉乳腺癌內分泌治療TAM耐藥提供新的方向和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象及材料

人乳腺癌MCF-7細胞系購于中國科學院上海細胞生物所，胎牛血清、RPMI1640 培養液等購自Gbico公司，TAM(溶于乙醇)購自Sigama公司；Transwell小室、ECL購于Millipore公司，DMSO、MTT試劑、SDS配膠試劑購于碧云天生物技術有限公司；兔抗人ITGB1、vimentin、fibronectin、N-cadherin和E-cadherin單克隆抗體(Abcam公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將細胞株接種至含有10%的胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養。每隔24 h更換培養液，待細胞融合度達到約80%時，進行消化傳代。

1.2.2 構建過表達ITGB1載體質粒及包裝反轉錄病毒 采用國內劉宇軒等[13]的方法，包裝反轉錄病毒及攜帶ITGB1基因表達的載體質粒。

1.2.3 建立過表達ITGB1基因的MCF-7細胞株 以每孔2×105個MCF-7細胞接種于6孔板中，12小時后，同時加入含有ITGB1反轉錄病毒的培養基和polybrene(5 μg/L)，另設空載體組和空白組。培養48 h轉染后，加入終濃度為3.8 mg/L嘌呤霉素篩選持續1周。高表達ITGB1的MCF-7細胞稱為MCF-7-ITGB1，空載體對照組稱為MCF-7-vector細胞；以qRT-PCR和Western blot檢測細胞轉染效率。

1.2.4 qRT-PCR檢測ITGB1 mRNA的表達 設計ITGB1引物，上游：5′-TTTGTTTAATGTCTGGTGCTTTCTG-3′,下游：3′-CCCCAAAATTGCAAACAAATACA-5′;內參照β-actin引物，上游：5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGCGA-3′;下游：3′-ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC-5′采用SYBR Green法，用Trizol提取實驗各組細胞DNA并反轉錄。設置條件：95℃條件下預變性30 s、變性10 s，溫度降至56.9℃退火30 s，72℃延伸20 s，反復40個循環,以Applied Biosystems SDS 14.0軟件進行熒光采集及數據分析，以β-actin為內參照，SDS14.0軟件分析其ΔCt值(目的基因Ct值-內參基因Ct值)及ΔΔCt值(實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值)，計算RQ(relative quantity)值，RQ=2- ΔΔCt，計算實驗組及對照組mRNA相對水平。

1.2.5 MTT法檢測不同濃度TAM對MCF-7-ITGB1細胞的增殖抑制率 把處于快速生長期濃度為1×105個/mL的MCF-7、MCF-7-vctor或MCF-7-ITGB1細胞懸液，接種至96孔板中，每組均設置8個復孔，分別加入終濃度為0、0.01、0.1、1、10、100 nmol/L TAM，其中0 nmol/L TAM組為對照組，另設只含培養基不含TAM和細胞作為空白組進行校正，培養箱放置2 d后，每實驗孔加入50 μL終濃度為5 mg/mL MTT溶液，待形成紫色結晶后加入DMSO溶解，Synergy2多功能酶表儀上檢測490 nm處各組吸光(optical density,OD)值，細胞增殖抑制率=[(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)]×100%。計算不同濃度TAM半數抑制濃度(half-maximal inhibitory concentrations,IC50)以及耐藥指數(resistance index,RI)。RI=IC50(MCF-7-ITGB1)/IC50(MCF-7-vector)。實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.6 ITGB1蛋白和EMT標志蛋白表達的測定 取對數生長期的MCF-7、MCF-7-vector、和MCF-7-ITGB1細胞，分別接種于6孔板中，經48 h培養后，收集細胞并提取總蛋白，考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度。電泳結束后使用半干轉膜法轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入一抗(ITGB1、vimentin、fibronectin、N-cadherin、E-cadherin)與內參一抗(β-actin)4 ℃孵育過夜后，TBST洗滌3次，每次10 min，經辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2 h后，TBST洗滌3次，每次10 min，使用ECL化學發光試劑盒顯影，通過CCD凝膠成像系統采集圖像。采用Quantity one軟件對Western blot檢測的上述蛋白條帶吸光度值進行圖像分析，用β-actin蛋白表達量進行組間校正，得到蛋白表達半定量分析柱狀圖。

1.2.7 細胞遷移和侵襲能力的檢測 取結晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5%的結晶紫溶液，用時用PBS溶液1∶5稀釋成0.1%的結晶紫染液。將細胞消化、離心、無血清重懸、并稀釋成1×105個/mL的細胞懸液。在Transwell小室的濾膜上提前加入濃度為0.5g/L的Matrigel，小室上室內加入200 μl細胞懸液，在小室下室加入500 μL完全培養基，放置于24孔板中，每組細胞設置3個復孔，持續培養12 h后取出小室，拭去未穿過膜的細胞，多聚甲醛固定細胞10 min，結晶紫染色5 min。將實驗小室放置在正置像差顯微鏡下，隨機選擇5個視野并計算穿膜細胞的平均數，評價ITGB1不同表達水平下細胞侵襲能力。Transwell遷移實驗操作步驟同上，但不加Matrigel。

1.3 統計學方法

所有實驗均獨立重復3次，采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，其中多組間數據的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2 結 果

2.1 各組細胞中ITGB1的表達差異

在MCF-7-ITGB1細胞中，ITGB1較MCF-7及MCF-7-vector細胞系mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.01，圖1)。

圖1 ITGB1基因和蛋白表達水平的檢測

2.2 TAM對過表達ITGB1的MCF-7-ITGB1細胞增殖活性的影響

實驗組0.01、0.1、1、10、100 nmol/L TAM較0 nmol/L TAM對照組對MCF-7-ITGB1細胞增殖抑制率分別為： 2.01%±1.65%、8.68%±2.46%、18.76%±3.49%、29.51%±3.21%、58.61%±3.76%。在1、10、100 nmol/L TAM濃度下MCF-7-ITGB1細胞組增殖抑制率明顯低于MCF-7和MCF-7-vector組，差異有統計學意義(P<0.05;圖2)。IC50=19.40 nmol/L，耐藥指數為16.93。

圖2 MTT法檢測過表達ITGB1后不同濃度TAM對MCF-7-ITGB1增殖的影響(MCF-7-ITGB1細胞系與MCF-7及MCF-7-vector相比，*P<0.05)

2.3 ITGB1對MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響

與MCF-7及MCF-7-vector細胞相比(圖3)，過表達ITGB1細胞系MCF-7-ITGB1遷移能力顯著增強(P<0.05)。MCF-7-ITGB1細胞系侵襲能力顯著增強(P<0.05)。

圖3 Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力(×200)

2.4 ITGB1對MCF-7細胞上皮間質轉化的影響

過表達ITGB1的細胞系MCF-7-ITGB1上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達顯著下調(P<0.05)；間質細胞標志蛋白vimentin、fibronectin、N-cadherin表達顯著上調(P<0.05)，ITGB1誘導細胞發生EMT(圖4)。

圖4 Western Blot檢測EMT標志蛋白的表達情況

3 討 論

目前，在乳腺癌內分泌治療中TAM作為絕經前早期患者一線治療仍無法替代，但臨床上觀察到仍有50%以上的患者在TAM治療過程中出現腫瘤的局部復發或遠處轉移，這部分患者臨床考慮與TAM耐受密切相關，因此研究TAM治療耐藥，尋找克服藥物耐受的方法并進行針對性的藥物開發有重要的臨床意義。國內外眾多學者發現乳腺癌在三苯氧胺耐藥前后基因表達差異明顯[14-15]。越來越多的實驗表明，ITGB1在多種惡性腫瘤治療繼發性耐受中扮演重要角色[6-7,16]。在乳腺惡性腫瘤繼發三苯氧胺耐藥的復雜機制中也可能發揮關鍵作用。近年來，國際上大多涉及乳腺腫瘤內分泌治療耐藥研究多以MCF-7細胞系或其變體為研究對象，故本實驗也選取MCF-7作為實驗對象；課題組前期發現ITGB1在乳腺癌野生型MCF-7細胞系中幾乎不表達，因此本實驗首先采用慢病毒轉染技術上調MCF-7細胞內ITGB1的表達，獲取穩定高表達的MCF-7-ITGB1細胞系；進一步研究ITGB1對腫瘤細胞TAM耐受及生長侵襲能力的影響。結果發現，在1、10、100 nmol/L TAM濃度下MCF-7-ITGB1的增殖抑制率及耐藥指數與對照組相比差異明顯，細胞生存率及耐藥指數均顯著提高，同時Transwell實驗發現MCF-7-ITGB1細胞遷移和侵襲能力也顯著增強，實驗結果為ITGB1可以提高MCF-7細胞他莫昔芬耐受，增強細胞遷移、侵襲能力提供直接證據。但是ITGB1引起細胞遷移和侵襲能力增強、TAM治療耐藥分子機制仍不十分清楚。

腫瘤微環境是包含多種由腫瘤細胞及相關細胞分泌的細胞外因子的復雜的組織環境，不僅在腫瘤的發生發展過程中扮演重要角色，還可通過多種機制誘導腫瘤細胞耐藥[17]。ITGB1分布于各類腫瘤細胞的表面,是介導腫瘤微環境與腫瘤細胞間信號轉導的最主要的細胞表面受體；Ramirez-Ricardo等[18]研究發現，ITGB1可與多種信號分子如纖維連接蛋白等結合后可形成細胞外基質-整合素-細胞骨架黏附物,由此不僅可以介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的黏附,還可以通過獨特的途徑活化下游Src、FAK激酶，而Src、FAK激酶的活化可以增強細胞的侵襲及轉移能力；Gu等[19]實驗表明乳腺腫瘤細胞對芳香化酶抑制劑耐藥的產生可能與ESR1基因突變后誘導腫瘤細胞發生EMT轉化相關，而EMT的發生可以進一步增強腫瘤細胞的侵襲及轉移能力。本研究通過構建穩定過表達ITGB1的MCF-7-ITGB1細胞系，同時對MCF-7及MCF-7-ITGB1細胞系EMT相關蛋白進行了檢測，結果發現與幾乎不表達ITGB1的野生型MCF-7細胞系相比，MCF-7-ITGB1細胞系上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯下調，但間質細胞相關蛋白vimentin、N-cadherin和fibronectin表達顯著上調，實驗表明高表達ITGB1可以促使MCF-7細胞發生EMT轉化，因此，我們推測ITGB1可能通過介導腫瘤細胞及腫瘤微環境間的信號轉導激活下游Src、FAK激酶及相關信號通路誘導MCF-7細胞發生EMT轉化，進而影響細胞遷移侵襲能力，導致腫瘤細胞治療耐藥，這或許為進一步具體研究ITGB1介導的TAM耐藥的分子機制提供了研究方向。

綜上所述，本實驗發現ITGB1在乳腺癌MCF-7中的過表達可以增強細胞遷移和侵襲能力，促使細胞發生三苯氧胺耐藥，其機制可能是通過腫瘤細胞表面受體ITGB1激活下游信號通路、活化Src、FAK激酶誘導MCF-7細胞發生EMT轉化相關，但ITGB1誘導細胞發生EMT、促使腫瘤耐藥的具體分子機制仍需進一步探討研究。總之，實驗結果豐富了現有的乳腺癌他莫昔芬耐藥機制，為克服耐藥和治療提供新的研究方向和潛在的治療靶點。

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