碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌株中耐藥基因的表達(dá)及對(duì)多黏菌素異質(zhì)性耐藥的研究

許磊，王廣芬，金雨虹，周妃妃，國(guó)建

銅綠假單胞菌（PA）是院內(nèi)感染中常見(jiàn)的條件致病菌之一。在免疫功能低下、長(zhǎng)期臥床及燒傷等患者中，PA 具有較高分離率，并可引起全身性感染等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療PA 的首選抗菌藥物之一。但隨著其廣泛應(yīng)用，在臨床逐漸檢出碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌（CRPA），給抗感染治療帶來(lái)極大困難，并造成不良的預(yù)后[2-3]。多黏菌素被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭陰性菌的最終選擇。但多黏菌素在鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等臨床治療中存在異質(zhì)性耐藥，往往造成抗感染治療失敗[4-5]。本研究對(duì)97 株CRPA 進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)與分析，并檢測(cè)CRPA 對(duì)多黏菌素異質(zhì)性耐藥的頻度，為臨床治療提供依據(jù)。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年1月至2020年2月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院住院患者中分離的CRPA 97 株，排除同一患者重復(fù)菌株。所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）和大腸埃希菌（ATCC25922），均購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.2 藥物試劑及儀器 抗生素亞胺培南、美羅培南、多黏菌素、比阿培南、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦，購(gòu)于Sigma 公司（上海）。肉湯培養(yǎng)基和Mueller-Hinton 瓊脂平板購(gòu)自O(shè)XOID公司（英國(guó)）。VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、濁度儀為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；PCR 儀為美國(guó)BIO-RAD 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種鑒定 參考《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》方法對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)、分離和鑒定，并根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果，篩選CRPA。

1.3.2 耐藥基因檢測(cè) 所提取的菌株，經(jīng)煮沸5 min 提取菌株總DNA。碳青霉烯酶相關(guān)基因（IMP、VIM、SIM、

GIM、SPM、NMD、OXA-1、OXA-2、OXA-10）及外膜蛋白（Opr）基因OprD2的特異性DNA 通過(guò)PCR 方法來(lái)測(cè)定。PCR 擴(kuò)增體系為：模DNA 共計(jì)2 l，上下游引物各0.5 l，2×Taq PCR MasterMix 10 l（夠自美國(guó)NewEnglandBioLab 公司），純水7 l。PCR 儀器條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火10s，72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，在瓊脂糖凝膠中電泳成像。所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.3 藥物敏感性檢測(cè) 將待測(cè)菌株與質(zhì)控菌株分別在Mueller-Hinton 瓊脂平板上37℃孵育過(guò)夜。制備0.5 麥?zhǔn)仙蠘泳骸Ｅ渲?2個(gè)濃度梯度的多黏菌素溶液，最高濃度為256 g/ml，依次將上樣菌液加入96 孔板，37℃培養(yǎng)20 h。以上均在無(wú)菌條件下完成。根據(jù)美國(guó)CLSI2014 的標(biāo)準(zhǔn)[最小抑菌濃度（MIC）≤2 g/ml 表示敏感，MIC=4 g/ml表示中介，MIC ＞4 g/ml 表示耐藥]來(lái)對(duì)判定菌株對(duì)多黏菌素敏感性。

1.3.4 群體譜分析 根據(jù)MIC 挑選對(duì)多黏菌素敏感的25 株進(jìn)行群體譜分析。分別配制含有不同濃度多黏菌素（0、1、2、4、8、16、32 及64 g/ml）的Mueller-Hinton 瓊脂平板。將0.5 麥?zhǔn)暇合♂?個(gè)梯度濃度，并植于Mueller-Hinton 瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落。取在最高濃度多黏菌素（64 g/ml）平板上生長(zhǎng)的菌落，經(jīng)無(wú)藥平板培養(yǎng)傳代72 h后，再次測(cè)定MIC。MIC＞2 g/ml 濃度多黏菌素平板上生長(zhǎng)的菌株為具有異質(zhì)性耐藥的菌株；此外，至少≥2倍MIC 濃度，但≤2 g/ml 濃度的多黏菌素平板上生長(zhǎng)的菌株，定義為異質(zhì)性[6]。

1.3.5 聯(lián)合用藥試驗(yàn) 選取6 株異質(zhì)性耐藥菌株以及相對(duì)應(yīng)的原始菌株，同時(shí)選取6 株無(wú)異質(zhì)性的菌株，進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。抗生素的組合方案為：多黏菌素分別聯(lián)合比阿培南、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。以4 倍根據(jù)藥物單獨(dú)MIC 作為最高濃度，并進(jìn)行8個(gè)梯度稀釋?zhuān)績(jī)煞N藥物1∶1 按降梯度方向加入96 孔板，37℃培養(yǎng)24 h，并計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：協(xié)同作用為FICI≤0.5，相加作用為0.5 ＜FICI≤1，無(wú)關(guān)作用為1 ＜FICI≤2，拮抗作用為FICI ＞2[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 25.0（美國(guó)IBM 公司）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的基本特征 共在97例住院感染患者中收集97 株無(wú)重復(fù)CRPA。其中男52例，女45例；60歲及以上58例，60歲以下39例。菌株主要來(lái)源于體液（包括痰液、肺泡灌洗液、尿液、血液、分泌物以及引流液等），其中痰液中占比最高。患者住院科室主要分布于ICU（最常見(jiàn)）、呼吸內(nèi)科、感染科和外科。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)PCR 驗(yàn)證：IMP 陽(yáng)性20 株（20.61%），VIM 陽(yáng)性11株（11.34%），SPM 陽(yáng)性9 株（9.27%），OXA-10 陽(yáng)性17 株（17.53%），OprD2 缺失62 株（63.92%）。

2.3 CRPA 多黏菌素MIC 值分布 95株（97.94%）對(duì)多黏菌素敏感，僅2 株呈中介，無(wú)耐藥菌株。見(jiàn)表2。

表2 CRPA 多黏菌素MIC 值分布

2.4 CRPA群體譜分析 在用于群體分析的25 株CRPA 中，8 株（32.00%）存在異質(zhì)性耐藥，5 株（20.00%）具有異質(zhì)性，12 株（48.00%）無(wú)異質(zhì)性。見(jiàn)表3。

表3 CRPA 群體譜分布

2.5 聯(lián)合用藥結(jié)果 異質(zhì)性耐藥菌株4+、47+、65+，75+，77+，78+及其相對(duì)應(yīng)的原始菌株表現(xiàn)出以協(xié)同作用和相加作用為主，部分卻表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用。無(wú)異質(zhì)性的菌株21、45、57、80、90、93 表現(xiàn)為協(xié)同作用、相加作用和無(wú)關(guān)作用。所有檢測(cè)的菌株均沒(méi)有出現(xiàn)拮抗作用。多黏菌素+比阿培南聯(lián)合作用最佳，有66.67%（12/18）的菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用，33.33%（6/18）的菌株表現(xiàn)相加作用。而多黏菌素+頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合作用表現(xiàn)最差，只有22.22%（4/18）的菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用。見(jiàn)表4。

表4 聯(lián)合用藥FICI

3 討論

PA耐青霉烯類(lèi)的主要機(jī)制為酶的生成，孔蛋白的缺失或主動(dòng)內(nèi)流[8]。PA 產(chǎn)生的青霉烯酶主要有 B 類(lèi)金屬酶（MBL，主要包括IMP、VIM、SIM、GIM、SPM、NMD）和D 類(lèi)苯唑西林酶（OXA，包括OXA-1、OXA-2、OXA-10 等）。與文獻(xiàn)[9]報(bào)道相似的是，本研究共收集97株CRPA 的結(jié)果提示IMP、VIM 和SPM可能是導(dǎo)致CRPA 耐藥性的主要金屬酶。此外，OXA-10 是引起CRPA 耐藥的主要OXA 類(lèi)型。

-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌外膜的水通道Opr 進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)[10]。OprD2是碳青霉烯類(lèi)的特異性通道，缺失或不表達(dá)會(huì)此蛋白的PA 對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥[11]。OprD2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的結(jié)果顯示，OprD2 缺失菌株 62 株（63.92%），因此推測(cè)CRPA 耐藥性可能與OprD2 缺失有關(guān)。

本研究對(duì)97 株CRPA進(jìn)行多黏菌素敏感性實(shí)驗(yàn)，其中95 株（97.94%）對(duì)此抗生素敏感，這表明多黏菌素對(duì)CRPA具有高度敏感性[12]。但需要臨床醫(yī)生重視的是，CRPA 對(duì)多黏菌素異質(zhì)性現(xiàn)象也逐漸凸顯[13]。本研究對(duì)25 株不同MIC 分布的CRPA 進(jìn)行群體譜分析，結(jié)果顯示8 株（32.0%）存在異質(zhì)性耐藥，5 株（20.00%）存在異質(zhì)性。這表明多黏菌素治療CRPA具有一定的潛在耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，其異質(zhì)性及異質(zhì)性耐藥可能使臨床抗感染治療更加困難，在臨床治療中應(yīng)加以重視。

由于CRPA 對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥性，及部分CRPA 菌株對(duì)多黏菌素異質(zhì)性或異質(zhì)性耐藥，同時(shí)增加多黏菌素劑量后腎毒性的發(fā)生率也相應(yīng)增加，故而采用多黏菌素為主聯(lián)合其他抗生素治療有一定的理論優(yōu)勢(shì)[14]。以往研究表明，多黏菌素聯(lián)合治療碳青霉烯耐藥性或產(chǎn)生碳青霉烯酶的革蘭陰性菌感染，同單用多黏菌素治療組相比較，有顯著的生存優(yōu)勢(shì)[15]。本研究聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中，多黏菌素與比阿培南聯(lián)合應(yīng)用抗菌效果最佳，這表明多黏菌素聯(lián)合用藥（特別是聯(lián)合比阿培南）有助于防止異質(zhì)性發(fā)展為耐藥性。

綜上所述，耐藥性基因的表達(dá)可能是CRPA產(chǎn)生抗生素耐藥的機(jī)制。CRPA對(duì)多黏菌素的敏感性仍很高，但對(duì)多黏菌素異質(zhì)性或異質(zhì)性耐藥仍然存在。聯(lián)合應(yīng)用抗生素可能有效殺滅CRPA并預(yù)防其多多黏菌素的耐藥。