基于UPLC-Q-TOF-MS分析下瘀血湯活性成分及其抗肝癌作用機制網絡藥理學研究

鄧哲，歐陽昭廣，龍紅萍，唐玲，朱文豪，孟繁穎，周思倩，懷家軒，田雪飛

1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南中醫藥大學方證轉化湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.廣州醫科大學附屬口腔醫院，廣東 廣州 510182；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208

原發性肝癌發病隱匿、侵襲及轉移性強、病程進展迅速、預后差。中醫藥治療肝癌具備一定優勢，研究顯示血瘀證是原發性肝癌最常見的基本證候。肝癌患者常出現脅腹部脹痛結塊、刺痛不移，舌質黯紅、有瘀斑瘀點，舌下脈絡瘀曲，脈澀等。國醫大師周仲瑛認為，血瘀是肝癌發病的重要病機，貫穿肝癌病程始終，也是促使癌毒形成的關鍵病理因素。下瘀血湯出自《金匱要略》，由大黃、桃仁、土鱉蟲組成，用于治療女子產后瘀血內停致少腹疼痛。國醫大師周岱翰將其用于辨治消化系統腫瘤，認為治療肝癌應以活血化瘀為主，選方以下瘀血湯為先。近年研究表明，下瘀血湯可抑制肝癌細胞增殖，促進其凋亡，且可輔助經動脈化療栓塞（TACE）治療原發性肝癌。目前對于下瘀血湯的活性成分及其治療原發性肝癌作用機制尚未明確。本研究應用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）對下瘀血湯的成分進行分析鑒定，結合網絡藥理學及分子對接探究下瘀血湯主要活性成分的作用靶點及信號通路，闡明其抗肝癌作用機制，并運用體外細胞實驗進行驗證，為下瘀血湯的深入研究與臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 藥物與細胞

下瘀血湯配方顆粒（按《金匱要略》原方配比，大黃∶桃仁∶土鱉蟲＝5∶1∶2，批號分別為1016935、1071233、1036473），廣東一方制藥有限公司。肝癌細胞HepG2和Huh-7細胞株，中國浙江美森細胞科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色譜-質譜聯用儀（配置MassHunter 質譜工作站），美國Agilent 公司；Biofuge primoR 臺式離心機，美國Thermo公司；Milli-Q超純水制備儀，美國Millipore公司；XS105電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。mRNA提取試劑盒（貨號DP501），北京天根生化科技有限公司；mRNA 反轉錄試劑盒（貨號E047-01B），蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司；胰蛋白酶（貨號CTCC-002-006）、DMEM 高糖培養基（貨號CTCC-002-008）、胎牛血清（貨號CTCC-002-001）、抗生素（貨號15240112），中國賽默飛世爾科技有限公司；色譜純乙腈、甲酸，自制超純水。

2 方法

2.1 下瘀血湯成分分析

2.1.1 供試品溶液制備

精密稱取下瘀血湯配方顆粒2.0 g，置50 mL錐形瓶中，分別加50%、70%、100%甲醇溶液30 mL，超聲溶解30 min，靜置后取2 mL溶液，室溫、8 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得樣品1 mL，置進樣瓶中，進樣分析。

2.1.2 色譜條件

Agilent Extend C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A為水（含0.1%甲酸）、B為乙腈，梯度洗脫（見表1），流速0.4 mL/min，進樣量1 μL。

表1 下瘀血湯成分測定流動相梯度洗脫程序（%）

2.1.3 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；準確質量數用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，采用正負離子分析模式，MRE掃描方式。一級掃描范圍：m/z 100～1 500；除溶劑氣為氮氣；干燥氣溫度325 ℃，體積流量6.8 L/min；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4.0 kV；Fragment電壓110 V。二級質譜Fragment電壓：10、20、40 kV；掃描范圍：m/z 100～1 000。

2.2 下瘀血湯成分潛在作用靶點收集

基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析得到的下瘀血湯化學成分信息，采用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）進行成分查詢及靶點收集。對于TCMSP未收錄成分，應用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢SMILES號，再使用SwissTargetPrediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點補充，選擇評分高的靶點。利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）將靶點全稱轉化為基因簡稱。

2.3 成分-靶點-疾病網絡構建

以“primarylivercancer”為關鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）數據庫，查找相應靶點，去掉假陽性和重復靶點后，建立原發性肝癌靶點數據集。通過R語言軟件（https://www.r-project.org/）將下瘀血湯活性成分靶點和原發性肝癌靶點進行匹配，獲得下瘀血湯抗肝癌潛在靶點。采用Cytoscape3.8.2 軟件（https://cytoscape.org/）構建下瘀血湯抗肝癌成分-靶點-疾病網絡。

2.4 蛋白相互作用網絡構建

將潛在靶點輸入STRING數據庫（https://string-db.org/），設置物種為“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用（PPI）關系，結果以TSV格式導出，應用R語言軟件計算靶點互作頻次，并繪制柱狀圖。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將下瘀血湯抗肝癌靶點導入Metascape 數據庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），設置物種為“Homo sapiens”，進行GO功能及KEGG通路富集分析。

2.6 分子對接

通過UniProt、PDB 數據庫下載核心靶點蛋白CASP3、ESR1、MYC、PPARG的3D結構，使用PyMOL軟件進行蛋白修飾，去除水分子與小分子配體，保存為pdb格式。在PubChem數據庫中查詢下瘀血湯主要活性成分的2D結構，采用Chem3D軟件對各成分結構進行優化。采用AutoDock Vina軟件對活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接，用結合能評價二者的結合能力。選取結合能較好的2個活性成分，借助PyMOL軟件將對接結果進行可視化繪圖。

2.7 實驗驗證

2.7.1 動物

SPF級SD大鼠20只，體質量270～300 g，雌雄各半，6～8周齡，購自湖南斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號ZS-202107050003，動物倫理編號LLBH-202106090001。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心屏障級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～80%，12 h/12 h光暗循環，普通飲食，適應性飼養1周后開始實驗。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審核批準。

2.7.2 血漿樣品制備

將大鼠隨機分為下瘀血湯含藥血清組和空白血清組，每組10只。下瘀血湯（大黃7.5 g，桃仁1.5 g，土鱉蟲3.0 g）換算成配方顆粒為2.0 g/劑，按臨床等效劑量的5倍給藥。下瘀血湯含藥血清組大鼠予0.18 g/d下瘀血湯灌胃，灌胃體積10 mL/kg。空白血清組予等量生理鹽水灌胃。每日2 次，連續5 d。取材前禁食12 h，末次給藥1 h后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，無菌條件下腹主動脈采血，常溫靜置，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾，-80 ℃保存備用。

2.7.3 CCK8法測定細胞增殖

將 HepG2 和 Huh-7 細胞以 1×10個/mL 接種于 96孔板，每孔100 μL，細胞培養24 h后，加入不同濃度含藥血清配制的細胞培養液，設置空白組、對照組及2.5%、5%、10%、15%、20%含藥血清組，每組6個復孔，加入相應含藥血清培養24 h，每孔加CCK8溶液10 μL（1/10培養基量），1 h后于酶標儀450 nm處測定吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率[（對照組OD值－給藥組OD值）÷（對照組OD值－空白組OD值）×100%]。

2.7.4 RT-qPCR檢測

將對數生長期HepG2和Huh-7細胞以2×10個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，設置對照組、實驗組，每組設3個復孔，于37 ℃、5%CO、飽和濕度培養箱中培養24 h，分別加入空白血清和20%下瘀血湯含藥血清培養48 h。提取總RNA并進行反轉錄，然后進行定量擴增。PCR反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃15 s、60 ℃ 30 s，40個循環。引物序列見表2。采用2法計算基因表達量。

表2 各基因PCR引物序列

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 下瘀血湯活性成分

下瘀血湯UPLC-ESI-Q-TOF-MS正負離子流圖見圖 1。運用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 工作站中的分子特征提取（MFE）功能，根據化合物的相對分子質量、質譜碎片離子信息，結合文獻[19-21]對成分進行鑒定。鑒定出下瘀血湯49個活性成分，其中大黃28個、桃仁17個、土鱉蟲4個。見表3。

圖1 下瘀血湯UPLC-ESI-Q-TOF-MS正負離子流圖

表3 下瘀血湯成分鑒定和歸屬

3.2 成分-靶點-疾病網絡分析

通過GeneCards、OMIM數據庫共獲取原發性肝癌相關靶點15 711個。應用R語言軟件將下瘀血湯活性成分靶點與肝癌相關靶點進行匹配，兩者取交集后獲得下瘀血湯抗肝癌潛在靶點63個。利用Cytoscape 3.8.2得到下瘀血湯抗肝癌成分-靶點-疾病網絡，見圖2。該網絡有82個節點、193條邊，平均度值4.7。預測得到下瘀血湯抗肝癌有效活性成分17個，其中大黃素甲醚、大黃素、亞油酸、棕櫚酸、蘆薈大黃素、山柰酚、沒食子酸、腺苷、尿嘧啶的度值＞5，度值≥2的成分占88.23%；交集靶點共63個，其度值≥2，其中NCOA2、PTGS1、GABRA1、F7、CASP3的度值≥5，度值≥3的靶點占30.15%。

圖2 下瘀血湯抗肝癌成分-靶點-疾病網絡

3.3 蛋白相互作用網絡分析

利用STRING數據庫得到下瘀血湯抗肝癌潛在靶點PPI網絡，結果見圖3。該網絡共63個節點、250條邊，平均度值7.98。由于靶點DIO1、SLC7A7、PRSS1、SLC22A5、F7 未參與PPI 網絡，故予剔除。其中度值≥3的靶點占76.19%，度值＞10的靶點主要有CASP3、ESR1、PPARG、MYC、RELA、CYP1A1、MAPK8、 PGR、 AR、 CYP3A4、 GSTP1、 AHR、CYP1B1、 ICAM1、 IKBKB、 CCNB1、 GSTM1、NCOA1、SLC2A4等，將其作為下瘀血湯抗肝癌核心靶點，30個核心靶點見圖4。相互作用頻次較高的靶點有CASP3、ESR1、PPARG、MYC，表明下瘀血湯活性成分與其有較高的結合活性，提示這些靶點可能是下瘀血湯抗肝癌的關鍵靶點。

圖3 下瘀血湯抗肝癌靶點PPI網絡

圖4 基于PPI網絡拓撲分析的下瘀血湯抗肝癌核心靶點

3.4 GO功能分析

對核心靶點進行GO功能分析，從生物過程、細胞組分和分子功能三方面進行基因功能注釋，＜0.01的前20個條目見圖5。結果顯示，核心靶點分子功能主要涉及氧化還原酶活性、核受體反應、谷胱甘肽轉移酶活性、脂質結合、激酶結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、整合素結合等；生物過程主要涉及激素反應、缺氧反應、化學應激的細胞反應、激素水平的調節、節律過程、細胞死亡的正向調節、炎癥反應、雌二醇反應、細胞內受體信號通路、細胞增殖的負調控、循環系統過程、上皮細胞增殖調節等；細胞組分主要涉及膜筏、復雜的轉錄調節因子、復雜受體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、細胞外基質、線粒體外膜等。

圖5 下瘀血湯抗肝癌潛在靶點GO富集分析

3.5 KEGG通路富集分析

對核心靶點進行KEGG通路富集分析，選取＜0.01的信號通路進行可視化，見圖6。與肝癌發病相關的機制主要涉及化學致癌作用-受體活化、癌癥通路、乙型肝炎、鞘脂信號通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥的MicroRNAs、AMPK信號通路、cGMP-PKG信號通路、緊密連接蛋白等。

圖6 下瘀血湯抗肝癌潛在靶點KEGG通路富集分析

3.6 分子對接結果

將下瘀血湯抗肝癌17個活性成分與4個關鍵靶點（CASP3、ESR1、MYC、PPARG）進行分子對接分析，結果見表4。結合能越小表示該活性成分與靶點蛋白的親和力越高，結合能＜-5.0 kcal/mol表明成分與靶點親和活性較強。分子對接結果顯示，大部分活性成分與靶點結合能＜-5.0 kcal/mol，表明下瘀血湯活性成分與4個關鍵靶點具有較好的親和力，其中兒茶素二聚體、大黃酚葡萄糖苷與CASP3、ESR1、MYC、PPARG的結合能＜-6.0 kcal/mol，且結合體構象較穩定，分子對接模式見圖7。

表4 下瘀血湯主要活性成分與核心靶點分子對接結合能（kcal/mol）

圖7 Procyanidin B1、Chrysophanol glucoside與關鍵靶點分子對接模式

3.7 下瘀血湯含藥血清對肝癌細胞增殖的影響

不同濃度（2.5%、5%、10%、15%、20%）下瘀血湯含藥血清作用于HepG2和Huh-7細胞12 h后，與對照組比較，血清濃度在10%開始對細胞增殖有抑制作用，細胞增殖抑制率隨血清濃度升高而增加，在含藥血清濃度為20%時抑制效果最佳（＜0.01），并可抑制靶點CASP3、ESR1、PPARG、MYC 表達（＜0.01）。見圖8、圖9。

圖8 不同濃度下瘀血湯含藥血清的肝癌細胞增殖抑制率（，n＝6）

圖9 下瘀血湯含藥血清對關鍵靶點表達的抑制作用（，n＝3）

4 討論

肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其高發病率、高死亡率、高惡性程度，以及臨床治療手段的缺乏，使探尋肝癌治療的新藥物、新靶點尤為迫切。肝癌與多種因素相關：持續肝炎病毒感染、長期酒精攝取、長時間接觸致癌劑黃曲霉素等，糖尿病、肥胖等代謝疾病也是誘發肝癌的危險因素。大多數肝癌由慢性炎癥發展而來，病程通常由慢性肝病發展成肝纖維化，再到肝硬化，最后惡化形成肝癌。中醫認為，肝纖維化-肝硬化-肝癌的病程是瘀血逐漸聚集形成毒結的表現。肝癌病機多為情志抑郁，氣機阻滯，血行不暢，導致氣滯血瘀；或由濕熱邪毒，或蟲蠱、酒毒為害日久，瘀血毒結聚于肝臟。“肝藏血”的生理特性決定其病理狀態下易肝血瘀阻，故血瘀貫穿病程始終，其肝纖維化-肝硬化-肝癌的過程也佐證“血瘀”病機。國醫大師周岱翰認為，肝癌病機不外肝氣郁結，氣滯血瘀，壅塞脈絡，無論初病、久病，活血化瘀是最常用之法，治療多以下瘀血湯為主方加減。下瘀血湯為《金匱要略》為婦人產后瘀血內停致少腹疼痛而設，“產婦腹痛，法當以枳實芍藥散，假令不愈者，此為腹中有干血著臍下，宜下瘀血湯主之；亦主經水不利”。方中大黃入血分，逐瘀蕩熱，推陳致新；桃仁活血化瘀，且有潤燥之功；土鱉蟲善開血閉，可攻干血，逐瘀破結。三藥合用，破血之功峻猛。因下瘀血湯有活血逐瘀、攻堅破積之長，故凡瘀血內行、瘀阻經絡之證均可因證施治，現代醫家將其辨證用于肝癌治療。現代研究顯示了下瘀血湯治療肝癌的有效性。如王曜等研究顯示，用下瘀血湯加減治療原發性肝癌肝熱血瘀證TACE術后患者，可有效改善患者的肝功能和生活質量，并減輕化療毒副反應。張浩等通過體內外實驗研究表明，下瘀血湯可有效抑制肝癌細胞與裸鼠皮下移植瘤的增殖，促進肝癌細胞凋亡。

本研究應用UPLC-ESI-Q-TOF-MS結合網絡藥理學明確下瘀血湯的有效成分，預測下瘀血湯抗肝癌的作用機制，并通過體外實驗進行驗證。UPLC-ESI-QTOF-MS鑒定出下瘀血湯49個化學成分，其中大黃28個、桃仁17個、土鱉蟲4個。成分-靶點-疾病網絡顯示，大黃中的沒食子酸、蘆薈苷、山柰酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酚葡萄糖苷，桃仁中的檸檬苦素、苦杏仁苷、兒茶素、棕櫚酸、β-谷甾醇乙酸酯、亞油酸，土鱉蟲中的腺苷、尿嘧啶為下瘀血湯潛在抗肝癌核心成分。山柰酚治療肝病-肝纖維化-肝癌前景良好，可通過多種抗氧化和抗凋亡機制保護肝實質細胞，降低肝臟微環境中的免疫炎癥反應，防止細胞凋亡，還可抑制內質網應激反應，抑制炎癥和腫瘤生長。兒茶素、苦杏仁苷對肝癌細胞具有抑制增殖、誘導凋亡的作用。蘆薈大黃素可有效抑制肝癌細胞的增殖與遷移，其機制與Src/STAT3信號通路相關。大黃素具有抑制肝癌細胞增殖、侵襲、轉移，促進凋亡，抑制腫瘤微環境血管新生等多重作用。大黃素甲醚可通過AMPK/Sp1/DNMT1信號通路上調miR-370誘導肝癌細胞凋亡。沒食子酸可通過抑癌基因p53抑制人肝癌細胞增殖，誘導凋亡。棕櫚酸可調節癌細胞膜流動性和葡萄糖代謝，發揮抑制肝細胞癌進展的作用。上述研究提示，下瘀血湯可能通過山柰酚、兒茶素、苦杏仁苷、蘆薈大黃素、大黃素等活性成分發揮抗肝癌作用。

核心靶點GO 和KEGG 通路富集分析結果中，PI3K-Akt是經典的炎癥信號通路，乙型肝炎是誘發肝癌的常見病因。肝癌具有男性多于女性的性別差異，激素水平可能是導致性別差異的關鍵因素。激活AMPK信號通路可通過抑制脂質代謝抑制肝癌細胞增殖。cGMP-PKG信號通路對維持血管穩態至關重要，激活cGMP-PKG信號通路可抑制腫瘤細胞血管生成，提示下瘀血湯可能通過該通路調控肝癌血管生成。緊密連接是上皮細胞間的黏連復合物，是腸屏障的重要組成部分，腸屏障的破壞會導致腸道致病菌透過腸屏障，通過腸-肝循環誘發肝癌。此外，通過抑制腫瘤細胞的缺氧、應激、炎癥、激酶結合等反應，可抑制肝癌的增殖、侵襲與轉移。因此，下瘀血湯可能通過PI3K-Akt信號通路、激素水平、AMPK信號通路調控的脂質代謝、cGMP-PKG信號通路調控的抗血管生長、緊密連接調控的腸屏障，以及缺氧、應激、炎癥、激酶結合等多途徑發揮抗肝癌作用。

下瘀血湯抗肝癌潛在靶點PPI 網絡篩選得到CASP3、ESR1、PPARG、MYC為下瘀血湯抗肝癌的關鍵潛在靶點。CASP3是腫瘤細胞凋亡的執行蛋白，通過促進CASP3活化可有效促進肝癌細胞的凋亡，抑制腫瘤生長，下瘀血湯中多種成分具有促進細胞凋亡的作用。對于肝癌發病的性別差異，ESR1是一個編碼雌激素受體，可抑制肝臟致癌并建立性別特異性基因表，下瘀血湯可能通過ESR1調節激素水平，影響肝癌發病的性別差異。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活的受體，PPARG的多態性可能會影響肝細胞癌的易感性，PPAR可通過鞘脂通路調控癌細胞凋亡，下瘀血湯可能通過抑制PPARG受體活化促進凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。MYC是最常見的活化原癌基因之一，可調節細胞的增殖和分化，MYC過表達可誘導侵襲性肝腫瘤，導致轉移形成，下瘀血湯可能通過作用于MYC抑制腫瘤的侵襲與轉移。分子對接結果顯示，下瘀血湯主要活性成分與上述靶點蛋白具有較好的親和力，其中大黃酚葡萄糖苷和兒茶素二聚體的結合能力最佳，提示下瘀血湯可能通過大黃酚葡萄糖苷和兒茶素二聚體抑制4個靶點，發揮抗肝癌作用。體外細胞實驗進一步明確了下瘀血湯對肝癌細胞增殖的抑制作用，以及對4個潛在關鍵靶點表達的抑制作用。

綜上所述，本研究基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術分析鑒定了下瘀血湯的化學成分，結合網絡藥理學提示山柰酚、兒茶素、苦杏仁苷、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚葡萄糖苷等是其發揮抗肝癌作用的主要活性成分。下瘀血湯抗肝癌的作用機制主要與PI3K-Akt信號通路、炎癥反應、激素水平調節、cGMP-PKG信號通路調控的抗血管生成、緊密連接調控的腸屏障、腫瘤細胞的缺氧、應激、激酶結合等途徑相關。CASP3、ESR1、PPARG、MYC是下瘀血湯抗肝癌的潛在核心靶點，分子對接顯示大黃酚葡萄糖苷、兒茶素二聚體與4個靶點蛋白有較好的親和活性。最后通過體外細胞實驗驗證了下瘀血湯抑制肝癌細胞增殖的能力，以及對關鍵靶點表達的抑制作用。本研究可為進一步闡明下瘀血湯抗肝癌的活性成分及作用機制提供研究方向和數據支持。