三黃膏對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染大鼠皮下軟組織炎癥及TLR2/NF-κB信號通路的影響

潘海邦，王天明，崔巖，李曉麗，付琦，陳乾，吳國泰，王波

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫藥大學護理學院，甘肅 蘭州 730000

體表軟組織感染是外科常見病，表現為由病原體入侵與繁殖所引起的炎癥反應，其中以金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌最常見。細菌通過皮膚黏膜侵入機體，大量增殖并誘發機體局部產生炎癥因子，激活相關細胞信號途徑關鍵分子如Toll樣受體（TLR）、核因子（NF）-κB等，誘導多種促炎因子和炎性介質釋放，引起全身炎癥反應。較為嚴重的皮下軟組織感染不但引起炎癥過度反應、局部紅腫、潰膿創面、組織壞死，膿腫形成，還可通過血液擴散，導致肺部感染、肝膿腫等，甚至引發敗血癥或感染性休克而危及生命。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是最常見的耐藥金黃色葡萄球菌，在體表感染組織、分泌物、膿液中檢出率較高，已成為臨床嚴重創傷、術后、老年體弱、重癥患者最主要的致死原因之一。據統計，全球每年至少有70萬人死于耐藥菌。

對于體表局部軟組織感染的治療，西醫主要采用局部處理、熱敷等，成膿后切開引流并給予抗生素治療。但手術引流創傷大，愈合周期長，需長期換藥，且抗生素濫用已成為重大用藥安全隱患，使MRSA等耐藥菌在臨床感染中日益增多。三黃膏為甘肅中醫藥大學附屬醫院院內制劑（甘藥準字Z04010878），具有清熱解毒、活血消腫、托毒排膿等作用，對于癤、癰、丹毒、膿腫等感染療效顯著，但其作用機制尚不明確。本實驗采用MRSA感染大鼠，觀察三黃膏對感染組織炎癥反應的影響，從TLR2/NF-κB通路探討其抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康Wistar大鼠96只，雌雄各半，體質量（280±10）g，甘肅中醫藥大學醫學實驗中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。單籠飼養于甘肅中醫藥大學科研實驗中心SPF級實驗室。實驗動物處理遵守動物倫理原則，本研究經甘肅中醫藥大學倫理委員會批準（2018-054）。

1.2 藥物

三黃膏（黃芩、黃連、黃柏），甘肅中醫藥大學附屬醫院提供，批號210329；莫匹羅星軟膏（百多邦），中美天津史克制藥有限公司，批號3L4K。

1.3 主要試劑與儀器

MRSA（ATCC 25923），甘肅省人民醫院臨床醫學轉化中心饋贈；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-7 ELISA 試劑盒（貨號分別為JL13202、JL20884、JL20897），上海將來實業股份有限公司；TLR2抗體、轉化生長因子-β活化激酶結合蛋白1（TAB1）抗體、NF-κB 抗體（批號分別為GR3348211-1、GR3273233-1、GR32932611），美國GeneTex 公司；TRlzol（批號152104），美國Ambion公司；反轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒（批號分別為AI40704A、AI61180A），日本TaKaRa公司；GAPDH抗 體 （批 號 B1501）， 美 國 ImmunoWay 公 司 。BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、CT14RD型高速低溫離心機，上海天美生化儀器設備工程公司；Benchmark Plus酶標儀、ChemiDOC XRS+凝膠成像分析系統，美國Bio-Rad公司；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 分組、造模及給藥

96只大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白組、模型組、百多邦組和三黃膏高、中、低劑量組，每組16只。參考Malachowa等方法造模，每只大鼠背部近頸側以脊柱為中線用簽字筆標記2 cm×2 cm區域脫毛，除空白組外，其余各組大鼠皮下注射濃度為6×10CFU/mL的MRSA菌懸液1 mL，空白組不做任何處理，以脫毛區域出現膿性感染灶表現為造模成功。造模次日開始外敷給藥，百多邦組按0.5 g/只涂抹百多邦（以凡士林調整藥膏總量為1 g/只），相當于臨床成人使用劑量的2倍；三黃膏高、中、低劑量組按1、0.5、0.25 g/只涂抹藥膏（以凡士林調整藥膏總量為1 g/只），相當于臨床成人使用劑量的4、2、1倍；空白組和模型涂抹等量凡士林，每日2次，連續7 d。每日觀察大鼠一般狀況及軟組織感染變化。

1.5 取材

干預結束后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉大鼠，心臟采血，分離大鼠皮下感染組織，使用預冷的生理鹽水沖洗干凈并分裝于凍存管中，放入液氮中凍存備用。

1.6 HE染色

4%多聚甲醛固定感染組織，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，梯度乙醇脫水，伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.7 ELISA檢測

大鼠心臟采血后3 000 r/min離心15 min，吸取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，計算血清TNF-α、IL-1β、IL-7含量。

1.8 RT-qPCR檢測

采用Trizol法提取總RNA，以RNA為模板反轉錄合成cDNA，根據RT-qPCR試劑盒說明書設置反應體系及參數，進行PCR。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。以β-actin 為內參，2法計算mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 Western blot檢測

取適量感染組織剪碎，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣后，依次進行電泳、轉膜、封閉，滴加TLR2一抗（1∶1 000）、TAB1一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影，凝膠成像分析系統成像，使用Quantity One軟件進行分析。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 三黃膏對模型大鼠一般情況的影響

空白組大鼠精神狀況良好，反應靈敏，進食正常，皮毛濃密且有光澤，大便成形、呈褐色；模型組大鼠造模后飲食減少，精神萎靡，皮毛色澤枯槁、易落；各給藥組大鼠在藥物干預后精神狀態好轉，飲食量恢復，毛色變光澤，大便成形，尤以三黃膏高劑量組較為明顯。造模前后皮膚組織變化見圖1。

圖1 大鼠造模前后皮膚對比

2.2 三黃膏對模型大鼠感染組織病理變化的影響

空白組大鼠皮膚組織結構清晰。模型組大鼠感染組織表皮層鱗狀上皮普遍增厚，膿腫區域表皮結構破壞、層次不清；真皮層變薄，染色加深，膠原纖維聚集成片狀、團塊狀，各層有大量炎性細胞浸潤；皮下組織結構減少。三黃膏高劑量組大鼠感染組織膠原纖維聚集明顯減少，周圍肉芽組織填充，有新生的薄壁毛細血管。三黃膏中劑量組大鼠感染組織損傷程度稍減輕，有少量肉芽組織及新生薄壁毛細血管。三黃膏低劑量組大鼠感染組織損傷程度較重，膠原纖維聚集成條索狀，壞死層較三黃膏高劑量組增加，肉芽組織填充較三黃膏高劑量組減少。見圖2。

圖2 各組大鼠感染組織形態（HE染色，×40）

2.3 三黃膏對模型大鼠血清及感染組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-7含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL7-含量明顯減少（＜0.05，＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量比較（）

2.4 三黃膏對模型大鼠感染組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-7、Toll 樣受體2、轉化生長因子-β活化激酶結合蛋白1、核因子-κB p65 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA 表達升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表達降低，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表達比較（）

2.5 三黃膏對模型大鼠感染組織Toll 樣受體2、轉化生長因子-β活化激酶結合蛋白1、核因子-κB p65蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達比較（）

3 討論

研究表明，TLR信號通路持續激活誘發炎癥因子“瀑布式”增加，進而導致炎癥反應持續存在。TLR2通過與TLR1或TLR6形成異源二聚體來識別嵌入葡萄球菌細胞膜中的脂蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖，CD14作為TLR2的共受體，能促進脂磷壁酸與質膜結合，增強NF-κB的活化。TAB1是一種與轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）的N端激酶結構域有關的接頭蛋白，是TAK1 持續激活必需的結合蛋白。TLR2在病原微生物刺激后招募接頭蛋白髓樣分化初級反應蛋白88，隨后啟動細胞內信號轉導，TAK1是TLR2/NF-κB信號通路的關鍵分子，與TAB1結合后使IκB激酶磷酸化，最終導致轉錄因子NF-κB核易位，促進下游炎癥因子產生。哺乳動物NF-κB是由5個相關蛋白質組成的家族，其結合形成二聚體，包括p50和p65，p65包含主要的NF-κB轉錄活性，因此負責大量促炎癥介質的表達，促進先天性免疫細胞白細胞招募。金黃色葡萄球菌的主要先天免疫刺激化合物是脂蛋白。研究顯示，TLR2缺陷型巨噬細胞對金黃色葡萄球菌肽聚糖的反應受損，TLR2缺乏增加了宿主對葡萄球菌的易感性。TNF-α和IL-1β是TLR2/NF-κB信號通路下游的促炎性細胞因子，主要由淋巴細胞、巨噬細胞及單核細胞響應微生物誘導產生，并參與正常炎癥反應和免疫反應。

三黃膏外敷治療體表軟組織感染療效確切，但作用機制不明，限制其進一步開發應用。本研究通過MRSA感染大鼠模型，觀察三黃膏外敷對感染軟組織的影響，從病理變化、信號通路關鍵分子在血清和感染組織的表達方面探究三黃膏抗炎機制。結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量顯著增加，TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白及mRNA表達顯著升高，提示皮下組織明顯感染，炎癥反應加重。與模型組比較，三黃膏外敷治療后，大鼠一般狀況及病理變化均明顯改善，上述因子表達有不同程度降低，說明三黃膏外敷能減輕MRSA引起的大鼠皮下軟組織炎癥反應，可能通過抑制TLR2/NF-κB信號通路關鍵因子TLR2、TAB1、NF-κB p65等表達，從而減少下游TNF-α、IL-1β、IL-7等促炎因子釋放，發揮抗炎作用。本研究可為三黃膏抗炎機制研究和進一步開發應用提供實驗依據，也為中藥治療耐藥菌感染提供新思路。