基于小腸黏膜菌群及腸緊密連接探討養心通脈方對冠心病血瘀證大鼠的作用機制

王詩，李杰，劉垠杏，張書萌，陳子君，陳伶利，2

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西醫結合病原生物學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

冠心病的主要病因是冠狀動脈粥樣硬化致血管腔狹窄，繼而心肌缺血，是多數發達國家的主要致死原因之一，在發展中國家也呈增長趨勢。血瘀證是冠心病臨床上最常見的證型。自2017年“心-腸軸”概念提出后，腸道菌群成為研究心血管疾病與腸道關聯性的新靶點。研究表明，冠心病與腸道菌群密切相關，冠心病的危險因素如高血壓、高血脂等與也腸道菌群關系密切。

腸道菌群定植于腸道黏膜內，構成腸黏膜屏障，與機體多種代謝產物發生生化作用。目前許多研究直接收集新鮮糞便或腸道內容物進行腸道菌群檢測，然而兩者并不能直接反映腸道菌群結構，且有研究表明，糞便菌群結構與胃腸道菌群結構存在顯著差異，且糞便菌群極易受飲食影響，相較糞便菌群，腸道黏膜菌群能夠更真實地反映機體腸道微生物特征。

養心通脈方由國家級中醫藥名師袁肇凱教授在中醫學家秦伯未先生臨證經驗基礎上化裁而成。臨床研究發現，養心通脈方可顯著改善冠心病心絞痛患者心功能和血流動力學，降低血脂、血糖。本研究采用16S rRNA測序技術分析冠心病血瘀證大鼠小腸黏膜菌群特點，采用透射電鏡及Western blot觀察大鼠回腸組織緊密連接變化，探討養心通脈方對冠心病血瘀證大鼠腸道菌群的影響及其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

6～8周齡SPF級雄性SD大鼠95只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號430727201101154332。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，明暗周期12 h，動物許可證號SYXK（湘）2019-0009。本實驗經湖南中醫藥大學動物倫理委員會審批（XMBH-201907230005）。大鼠高脂飼料（81.3%基礎飼料、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 藥物

養心通脈方（人參10 g，丹參10 g，桂枝10 g，枳實10 g，澤瀉10 g），飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，加水煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮45 min，第二次加4倍量水煎煮30 min，合并2次煎液，濃縮至原藥材濃度為2 g/mL 溶液。阿托伐他汀鈣片，批號210823，北京嘉林藥業股份有限公司，用蒸餾水配制成濃度為0.4 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

維生素D3（批號J14O10R99577，上海源葉生物科技有限公司），鹽酸異丙腎上腺素（批號Z21N10X10 3254，上海源葉生物科技有限公司），Occludin、GAPDH兔多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔二抗（貨號分別為13409-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2，美國Proteintech公司），糞便基因組DNA提取試劑盒（貨號DP328，北京天根生化科技有限公司）。HS-3345全自動組織切片機（金華市華速科技有限公司），EM UC7超薄切片機（德國徠卡公司），HT7700透射電鏡（日本日立高新技術公司），電泳儀（美國伯樂公司），ChemiDoC XRS+化學發光凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

95只大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為正常組12只和造模組83只。采用病證結合造模法，參照課題組前期方法，造模組于造模第1、3日灌胃0.5 g/mL維生素D3溶液3 g/kg，造模第5日再灌胃維生素D3溶液2 g/kg。高脂飼料喂養12周后，連續2 d（間隔24 h）皮下注射異丙腎上腺素30 mg/kg。繼續高脂飼料喂養2周后進行心電圖檢測，隨機從正常組抽取4只、造模組抽取8只進行血液流變學檢測，異常則提示血瘀證造模成功，心電圖出現ST段抬高提示冠心病造模成功。

2.2 分組與給藥

從造模組大鼠中篩選出48只具有顯著冠心病心電圖特征的大鼠，將其中24只隨機分為模型組、養心通脈方組和阿托伐他汀組，每組8只。養心通脈方組予養心通脈方溶液18 g/kg灌胃，阿托伐他汀組予阿托伐他汀溶液1.8 mg/kg灌胃，正常組和模型組予蒸餾水4 mL/kg灌胃，連續2周，并繼續高脂飼料喂養。剩余24只大鼠用于糞菌移植實驗。

2.3 糞菌移植實驗

參照文獻[13]方法，自藥物干預第6日起，每日收集各組大鼠新鮮糞便5 g，置于-80 ℃冰箱保存。使用時加入25 mL無菌生理鹽水，攪拌均勻后，濾網（270目）過濾，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，沉淀用25 mL生理鹽水重懸，即得糞菌液（0.2 g/mL）。將剩余24只造模大鼠隨機分為正常大鼠糞菌移植組、模型大鼠糞菌移植組和養心通脈方大鼠糞菌移植組，每組8只，分別予正常組大鼠糞菌液、模型組大鼠糞菌液、養心通脈方組大鼠糞菌液1 g/kg灌胃，連續2周，并繼續予高脂飼料喂養。

2.4 取材

干預結束后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠，無菌條件下打開大鼠腹腔，自回盲瓣向上取回腸組織約8 cm，無菌PBS緩沖液清洗，迅速置于干冰中速凍，轉至-80 ℃超低溫冰箱中保存。每組隨機選取3只大鼠，剪開大鼠胸腔，剪取完整心臟，生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定。

2.5 冠狀動脈組織病理觀察

4%多聚甲醛固定心臟組織48 h，常規石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察冠狀動脈病理變化。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，依據美國心臟協會標準計算冠狀動脈粥樣硬化斑塊百分比（斑塊總面積÷血管總截面積×100%，斑塊總面積為血管內膜到中膜彈力層的范圍）。

2.6 回腸黏膜菌群16S rRNA測序及生物信息分析

從冰箱中取出回腸組織，解凍后用無菌蓋玻片刮取附著在回腸黏膜表面的細菌，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA，液氮速凍后轉至-80 ℃超低溫冰箱保存，用于16S rRNA測序。采用Illumina NovaSeq平臺對測序樣本進行雙端測序，測序數據分析使用QIIME2 軟件，使用QIIME2 推薦的DADA2 方法去噪去嵌合，選取OTU 的代表性序列，與微生物物種注釋數據庫Greengenes Database 13_8比對獲得物種注釋信息。

2.7 回腸組織電鏡觀察

低溫下將回腸組織切成1～2 m小塊，置于2.5%戊二醛溶液中固定4 h，梯度乙醇脫水，丙酮-812包埋劑（2∶1）滲透過夜，純812包埋劑包埋8 h，超薄切片機切片（厚度60～80 nm），2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，置于透射電鏡下觀察。

2.8 Western blot檢測

取適量回腸組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。蛋白上樣量100 μg，電泳，200 mA轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Occludin（1∶1 000）、GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶8 000），37 ℃孵育1.5 h，TBST洗膜，凝膠成像儀中顯影，采用Image J軟件計算蛋白相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 養心通脈方對模型大鼠冠狀動脈組織病理形態的影響

正常組大鼠冠狀動脈組織形態完整，細胞排列規則，未見明顯病理改變；模型組大鼠冠狀動脈組織內膜增生，有纖維帽沉積并向管腔突起，管腔呈新月形狹窄，內膜下有大量空泡狀噬脂細胞，病變累及中膜肌層組織；養心通脈方組大鼠冠狀動脈組織內膜結構較完整，內膜下沉積少量噬脂細胞，病變顯著改善；阿托伐他汀組大鼠冠狀動脈組織管腔較狹窄，內膜下可見明顯噬脂細胞沉積。見圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動脈組織形態（HE染色，×200）

與正常組比較，模型組大鼠冠狀動脈粥樣硬化斑塊百分比顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，養心通脈方組大鼠冠狀動脈粥樣硬化斑塊百分比顯著降低（＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠冠狀動脈粥樣硬化斑塊百分比比較（，%）

4.2 養心通脈方對模型大鼠腸道菌群的影響

4.2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性包括豐富度指數Chao1和均勻度指數Shannon。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群Shannon顯著降低（＜0.05），Chao1有降低趨勢，但差異無統計學意義（＞0.05）；與模型組比較，養心通脈方組大鼠腸道菌群Chao1、Shannon顯著升高（＜0.05，＜0.01），阿托伐他汀組大鼠腸道菌群Shannon顯著升高（＜0.01），其余各組差異無統計學意義（0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性比較（，每組8只）

4.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性能反映各組之間菌群結構的相似性和差異性，Unweighted Unifrac距離基于物種系統進化關系，Bray Curtis距離僅考慮物種存在與否及其豐度，兩者是估算微生物群落樣本間距離的方法，樣本間相似性越高，距離數值越小。Unweighted Unifrac 和Bray Curtis距離可以用非度量多維尺度法（NMDS）和主坐標分析（PCoA）在二維或三維空間進行排序展示，體現菌群群落的空間分布。各組Unweighted Unifrac距離和Bray Curtis距離差異有統計學意義（q＜0.05），提示各組大鼠腸道菌群結構有顯著差異，正常組和模型組大鼠腸道菌群結構差異較大，養心通脈方組與正常組腸道菌群結構相似，與阿托伐他汀組菌群結構也具有一定相似性。糞菌移植實驗中，模型大鼠糞菌移植組與正常大鼠糞菌移植組腸道菌群結構差異較大，養心通脈方糞菌移植組和正常大鼠糞菌移植組腸道菌群結構相似。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠腸道菌群NMDS分析

圖4 各組大鼠腸道菌群PCoA分析

4.2.3 菌群結構分析

16S rRNA測序共獲得2 096 791條原始序列，去除原始序列中的非特異性擴增片段和嵌合體后，每組獲得平均有效序列69 889～116 057 條，與Greengenes Database 13_8 數據庫比較，各組測序覆蓋率＞98%，說明測序結果可反映樣本的真實情況。門分類水平上豐度排名前3位是變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、酸桿菌門Acidobacteria。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群厚壁菌門Firmicutes豐度顯著降低（＜0.01），變形菌門Proteobacteria豐度顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度顯著升高（＜0.05），變形菌門豐度顯著降低（＜0.05）；養心通脈方組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度有升高趨勢，變形菌門豐度有降低趨勢，但差異無統計學意義（＞0.05）；正常大鼠糞菌移植組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度顯著升高（＜0.05），變形菌門豐度顯著降低（＜0.01），提示糞菌移植可以重塑冠心病血瘀證大鼠腸道菌群。屬水平上豐度排名前3位是羅爾斯通菌屬，未鑒別的消化鏈球菌科菌屬，未鑒別的梭菌目菌屬。見圖5、表2。

表2 各組大鼠腸道菌群相對豐度比較（，%）

圖5 各組大鼠腸道菌群物種分布

厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值與腸道菌群穩態有關，比值升高或降低表明腸道菌群失衡。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群F/B 比值顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，養心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠腸道菌群F/B 比值升高，但差異無統計學意義（＞0.05）；與模型大鼠糞菌移植組比較，養心通脈方糞菌移植組大鼠腸道菌群F/B比值升高，但差異無統計學意義（＞0.05）。

4.2.4 差異物種篩選

LefSe分析可直接對不同組間樣品所有分類水平同時進行差異分析，找出差異物種。LDA score越大，表示差異物種的影響越大。由圖6可見，LDA score＞2的差異物種共31種，致病菌變形菌門Proteobacteria對模型組有顯著影響（LDA score＞5.5），有益菌厚壁菌門Firmicutes對正常組有顯著影響（LDA score＞5.5），有益菌泉古菌門Crenarchaeota對養心通脈方組有顯著影響（LDA score＞4），有益菌乳桿菌科Lactobacillaceae對阿托伐他汀組有顯著影響（LDA score＞4.5）。各組特征菌群的分類水平所屬關系見圖7，可以推斷菌群的進化關系。模型組目水平有嗜甲基菌目Methylophilales和甲基球菌目Methylococcales 2個物種，科水平有嗜甲基菌科Methylophilaceae等3個物種；養心通脈方組目水平有亞硝基球菌目Nitrososphaerales 1個物種，科水平有亞硝基球菌科Nitrososphaeraceae 1個物種。

圖6 各組大鼠腸道菌群LDA score分布

圖7 各組大鼠腸道菌群環形進化圖

4.3 養心通脈方對模型大鼠回腸組織超微結構的影響

透射電鏡觀察顯示，正常組大鼠回腸組織緊密連接，橋粒結構清晰，形態完整，微絨毛排列密集整齊；模型組大鼠回腸組織緊密連接減少，結構模糊不清，橋粒數量減少，微絨毛排列稀疏；養心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠回腸組織緊密連接有所改善，結構較清晰，橋粒數量增多。見圖8。

圖8 各組大鼠回腸組織超微結構

4.4 養心通脈方對模型大鼠回腸組織Occludin 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，養心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），提示養心通脈方可以重建回腸屏障功能。見圖9、表3。

圖9 各組大鼠回腸組織Occludin蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達比較（）

5 討論

冠心病屬中醫學“胸痹”“真心痛”范疇目前西醫治療冠心病主要采用鈣通道拮抗劑、硝酸酯類、β-腎上腺素受體阻滯劑、抗血小板藥物、降脂類藥物（阿托伐他汀），但長期服用會導致不良反應。老年冠心病患者經介入治療，術后5年內生存率僅70%。養心通脈方以“扶養心氣，疏通血脈”為基本治法，方中人參補益心氣，丹參行氣活血、化瘀通脈，桂枝助陽化氣、溫通血脈、理氣活血，枳實理氣消痰，澤瀉利水補陰。全方標本兼治、通補兼施，共奏補氣益氣、養陰生津、養心通脈、活血化瘀功效。現代藥理研究表明，人參主要活性成分人參皂苷類具有抗氧化、抑制血栓形成、抑制炎癥反應等作用；丹參主要活性成分丹參酮類和丹酚酸類具有抗血小板聚集、抗氧化應激、抗炎、降糖功效；枳實活性成分黃酮和揮發油類抗氧化能力極佳；澤瀉主要活性成分三萜類具有降脂、降糖功能。

本研究從冠心病血瘀證模型大鼠回腸黏膜菌群狀態出發，進行藥物干預和糞菌移植實驗。結果顯示，模型組大鼠腸道菌群有益菌厚壁菌門豐度減少，致病菌變形菌門豐度增加；養心通脈方組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度增加，變形菌門豐度減少，菌群結構趨于正常，提示養心通脈方可能通過調節模型大鼠腸道菌群，恢復紊亂的腸道微生態，進而治療冠心病血瘀證。

Occludin 蛋白通過招募閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）調節細胞之間連接，維持腸道屏障功能。研究表明，腸道菌群失調會導致Occludin蛋白表達下調。本研究中，養心通脈方能上調模型大鼠回腸組織Occludin蛋白表達。透射電鏡觀察顯示，養心通脈方組回腸組織緊密連接較完整，橋粒數量增多，提示養心通脈方能夠改善腸道黏膜細胞間連接，修復腸道機械屏障功能。

本研究篩選出30余種差異腸道菌群，這些腸道菌群可能與疾病和中藥作用機制有緊密聯系，具有深入研究的意義和價值。本研究腸道菌群LDA score分布顯示，泉古菌門是養心通脈方組的優勢菌群，目前泉古菌門與疾病之間的關聯還不明確，中藥、腸道菌群和冠心病三者之間相互聯系的靶點也尚不清楚，有待今后進一步研究。