基于標準湯劑的羅布麻葉配方顆粒質量標準研究

何民友，李振雨，王利偉，段志文，楊潔，葉瑞平，陳向東

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻L.的干燥葉，以“澤漆”之名始載于《救荒本草》，《本草綱目拾遺》言其“利消痰如神”?，F代藥理研究表明，羅布麻葉具有降血壓、降血脂、抗糖尿病血管病變、抗氧化、保肝、抗抑郁、利尿等多種生物活性。羅布麻是一種抗逆性極強的宿根性多年生直立半灌木，多野生在鹽堿、荒漠地區，在我國主要分布于新疆、甘肅、青海、內蒙古、江蘇、陜西、山東、安徽、寧夏、山西、河北、河南、遼寧等。羅布麻葉中主要含黃酮類、有機酸類、鞣質、甾體類等化學成分，黃酮類化合物為其主要活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、降血壓、降血脂、保肝等作用。

中藥飲片標準湯劑是根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（以下簡稱《技術要求》）中“研究表征標準湯劑用湯劑的制備”項的指導原則，參考中藥藥性及入藥部位的分類，并參照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》（國中醫藥發〔2009〕3號）制備而成的中藥飲片水煎劑。中藥配方顆粒是傳統中藥飲片的改良產品，是中藥現代化的有益嘗試，具有安全衛生、攜帶方便、便于調劑、質量保證等優點。中藥配方顆粒的藥學研究報告工藝參數確定、質量控制方法和指標選擇、限度制定，均須與標準湯劑進行對比，以保證質量一致性。為更好評價羅布麻葉配方顆粒的質量，本研究選用19批主產區羅布麻葉藥材，按2018年版《上海市中藥飲片炮制規范》炮制后制備標準湯劑，以出膏率、金絲桃苷和異槲皮苷的含量及轉移率、指紋圖譜為參照，對羅布麻葉配方顆粒的質量進行評價，為羅布麻葉配方顆粒質量標準的制定提供依據。

1 儀器與試藥

H-Class 超高效液相色譜儀，美國沃特世有限公司；Vanquish 超高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；HWS28恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；KQ500DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Direct超純水系統，默克股份有限公司。

19批羅布麻葉藥材，來自6個省份，由廣東一方制藥有限公司采購管理部人員于產地采收，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為夾竹桃科植物羅布麻L.的干燥葉。根據2020 年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）羅布麻葉項下規定，經廣東一方制藥有限公司質量中心檢定合格，產地信息見表1。2020年版《中國藥典》羅布麻葉項下無飲片項，按2018年版《上海市中藥飲片炮制規范》羅布麻葉項下規定，將藥材除去枝梗等雜質，篩去灰屑，制得19批羅布麻葉飲片（LBMY01～LBMY19）。

表1 19批羅布麻葉樣品產地信息

對照品新綠原酸（批號wkq18030107，含量≥98%）、隱綠原酸（批號wkq16081903，含量≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司；綠原酸（批號110753-201817，含量96.8%）、金絲桃苷（批號111521-201708，含量95.1%）、異槲皮苷（批號111809-201403，含量92.9%）、槲皮素（批號200081-201509，含量98.6%）、山柰酚（批號110860-201611，含量95.5%），中國食品藥品檢定研究院。乙醇、甲醇為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；液相用磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）為色譜級，水為超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 羅布麻葉標準湯劑和配方顆粒制備

根據《技術要求》和《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，確定羅布麻葉標準湯劑的制備工藝為：取羅布麻葉飲片100 g，加水煎煮2次。第1次加12倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，用350目篩網趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻，第2次加10倍量水，煎煮25 min，用350目篩網趁熱過濾，濾液迅速冷水冷卻，合并2次濾液，合并后的濾液轉移至旋轉蒸發儀中，減壓濃縮為100 mL的濃縮液，冷凍干燥，得標準湯劑凍干粉。

取羅布麻葉飲片3 000 g，加水煎煮2次。第1次加投料量10倍量水，煎煮1.0 h；第2次加投料量8倍量水，煎煮0.5 h，煎液過濾，濾液50～80 ℃減壓濃縮為相對密度1.08～1.10（80 ℃）的清膏，過濾，加入適量麥芽糊精，噴霧干燥，再加入適量麥芽糊精和二氧化硅，混勻，干法制粒，制成1 000 g，即得。取3批羅布麻葉飲片（LBMY01、LBMY02、LBMY03）按上述制備3批羅布麻葉配方顆粒（KL01、KL02、KL03）。

2.2 出膏率測定

標準湯劑出膏率（%）＝凍干粉質量÷制備標準湯劑所用的飲片質量×100%。配方顆粒出膏率（%）＝清膏干膏粉量÷飲片投料量×100%。測定結果見表2。

表2 19批羅布麻葉標準湯劑和3批配方顆粒出膏率測定結果（%）

19 批羅布麻葉標準湯劑出膏率范圍為25.5%～30.8%，均值為28.8%，標準偏差（SD）＝1.4%。根據《技術要求》，標準湯劑出膏率的允許范圍為均值±3SD或均值的70%～130%，出膏率均值±3SD 為24.6%～33.0%，出膏率均值的70%～130%為20.2%～37.5%，結合出膏率數據波動情況，出膏率范圍選擇均值的70%～均值+3SD較為合理，即羅布麻葉標準湯劑的出膏率可接受范圍應為20.2%～33.0%。3批羅布麻葉配方顆粒出膏率分別為28.6%、30.9%、27.9%，均在標準湯劑出膏率范圍內，表明配方顆粒的工藝符合要求。

2.3 指標成分含量測定

2.3.1 色譜條件

采用WatersCORTECST3色譜柱（2.1mm×100mm，1.6 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A），流速0.3 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫35 ℃，進樣量1 μL。

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取金絲桃苷2.225 mg 和異槲皮苷對照品2.377 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷211.598 μg和異槲皮苷220.823 μg的混合溶液，搖勻；再精密吸取上述混合溶液3 mL轉移至10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷63.479 μg、異槲皮苷66.247 μg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備

取標準湯劑凍干粉適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中加70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察

精密稱定金絲桃苷對照品6.325 mg和異槲皮苷對照品8.153 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷601.508 μg和異槲皮苷757.414 μg的混合對照品貯備液；再精密量取上述金絲桃苷和異槲皮苷混合對照品貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，連同對照品貯備液，分別按“2.3.1”項下色譜條件依次進樣1 μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，進行線性回歸。金絲桃苷回歸方程為：＝7 411 511.0＋1 755.0，＝0.999 7，表明在15.038～601.508 μg/mL范圍內對照品濃度與峰面積線性關系良好；異槲皮苷回歸方程為：＝7 514 521.6＋3 520.8，＝0.999 7，表明在 18.935～757.414 μg/mL 范圍內對照品濃度與峰面積線性關系良好。

2.3.4.2 精密度試驗

取羅布麻葉標準湯劑（LBMY05）供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積，計算RSD，結果金絲桃苷峰面積RSD＝0.19%，異槲皮苷峰面積RSD＝0.17%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復性試驗

取同一批羅布麻葉標準湯劑（LBMY05）約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.3.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別進樣測定。結果金絲桃苷平均含量為8.86 mg/g，RSD＝0.45%；異槲皮苷平均含量為8.11 mg/g，RSD＝0.40%。表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 穩定性試驗

取羅布麻葉標準湯劑（LBMY05）供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積，計算RSD，結果金絲桃苷峰面積RSD＝1.12%，異槲皮苷峰面積RSD＝1.08%，表明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗

精密稱定金絲桃苷對照品9.115 mg和異槲皮苷對照品8.926 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷866.837 μg和異槲皮苷829.225 μg的對照品貯備液。取9個具塞錐形瓶，分為3組，每組3個，依次向3組錐形瓶中精密加入上述對照品貯備液0.5、1.0、1.5 mL，氮氣吹干，向每個瓶中加入已知含量的羅布麻葉標準湯劑凍干粉（LBMY05）約0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制成加樣回收供試品溶液9份，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果

2.3.5 樣品指標成分含量測定及轉移率計算

標準湯劑轉移率（%）＝（標準湯劑凍干粉指標成分含量×標準湯劑凍干粉量）÷制備標準湯劑所用飲片指標成分總量×100%；配方顆粒轉移率（%）＝配方顆粒中指標成分總量÷制備配方顆粒所用飲片指標成分總量×100%。

按“2.3.3”項下方法，制備19批羅布麻葉標準湯劑供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算金絲桃苷和異槲皮苷的含量和轉移率。取羅布麻葉配方顆粒樣品適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法，制備配方顆粒供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算金絲桃苷和異槲皮苷的含量和轉移率。

19 批羅布麻葉標準湯劑金絲桃苷平均含量為0.93%（SD＝0.11%），平均轉移率為61.09%（SD＝10.04%）；異槲皮苷平均含量為0.93%（SD＝0.15%），平均轉移率為63.67%（SD＝9.33%）。金絲桃苷和異槲皮苷含量波動較大，轉移率較穩定，標準湯劑金絲桃苷和異槲皮苷的含量與藥材、飲片含量的相關性較高。根據《技術要求》，配方顆粒的含量和轉移率應與標準湯劑一致。由于配方顆粒在制備過程中加入了一定的輔料輔助成型，因此，標準湯劑金絲桃苷和異槲皮苷的含量應按照配方顆粒33.3%的制成量進行折算，從而確定配方顆粒的含量范圍。19批羅布麻葉標準湯劑按照33.3%的制成量折算成19批配方顆粒的金絲桃苷含量均值為8.02 mg/g，SD＝0.73 mg/g，以均值±3SD作為羅布麻葉配方顆粒金絲桃苷含量的可接受范圍，確定羅布麻葉配方顆粒金絲桃苷的含量范圍為5.82～10.22 mg/g；按33.3%的制成量折算成19批配方顆粒的異槲皮苷含量均值為8.03 mg/g，SD＝0.94 mg/g，以均值±3SD作為羅布麻葉配方顆粒異槲皮苷含量的可接受范圍，確定羅布麻葉配方顆粒異槲皮苷的含量范圍為5.20～10.87 mg/g。以均值±3SD作為羅布麻葉標準湯劑和配方顆粒成品的轉移率可接受范圍，確定金絲桃苷的轉移率范圍為30.97%～91.20%，異槲皮苷的轉移率范圍為35.67%～91.66%，結果見表4。3批羅布麻葉配方顆粒金絲桃苷的含量分別為6.9、7.3、6.8 mg/g，異槲皮苷的含量分別為6.6、7.2、6.6 mg/g；3批羅布麻葉配方顆粒金絲桃苷的轉移率分別為65.5%、70.7%、62.8%，異槲皮苷的轉移率分別為64.0%、69.0%、62.4%。3批羅布麻葉配方顆粒金絲桃苷和異槲皮苷的含量和轉移率均與標準湯劑一致，表明配方顆粒的工藝符合要求。

表4 19批羅布麻葉標準湯劑含量測定結果

2.4 特征圖譜

2.4.1 色譜條件

同“2.3.1”項下。

2.4.2 對照品溶液制備

取新綠原酸、隱綠原酸、槲皮素和山柰酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，即得。取綠原酸、金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備

同“2.3.3”項下。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 精密度試驗

取羅布麻葉標準湯劑凍干粉（LBMY05）研細，取約0.2 g，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件重復進樣6次，以綠原酸為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD 為0.09%～0.23%，相對峰面積RSD 為0.13%～2.36%，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 穩定性試驗

取“2.4.4.1”項下羅布麻葉標準湯劑（LBMY05）供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，以綠原酸為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD為0.02%～0.65%，相對峰面積RSD為0.28%～2.29%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4.3 重復性試驗

取同一批羅布麻葉標準湯劑（LBMY05）約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.4.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以綠原酸為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD 為0.03%～0.75%，相對峰面積RSD 為0.10%～2.61%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 標準湯劑指紋圖譜

按“2.4.3”項下方法制備19批羅布麻葉標準湯劑（LBMY01～LBMY19）供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各批標準湯劑指紋圖譜，導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）軟件，以LBMY01指紋圖譜為參照圖譜，進行共有峰標識，并進行保留時間校正和峰匹配（見圖1），生成對照圖譜（見圖2），標定7個共有指紋峰，通過對照品比對全部指認，峰1～峰7依次為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚（見圖3）。以峰型較高、分離度較好、對照品易得的綠原酸為參照峰S，計算峰1～峰7與S峰的相對保留時間分別為0.60、1.00、1.12、2.80、2.98、5.05、5.10。各批標準湯劑樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度見表5，均在0.990以上，表明19批羅布麻葉標準湯劑的化學成分差異性較小，質量較穩定。

圖1 19批羅布麻葉標準湯劑UPLC圖譜

圖2 羅布麻葉標準湯劑對照圖譜

圖3 羅布麻葉標準湯劑指紋圖譜共有峰指認

表5 羅布麻葉標準湯劑指紋圖譜相似度評價

2.4.6 配方顆粒指紋圖譜

按“2.4.3”項下方法，制備3批羅布麻葉配方顆粒（KL01、KL02、KL03）供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄3批配方顆粒樣品指紋圖譜（見圖4），進行共有峰標識，并計算3批配方顆粒樣品指紋圖譜與羅布麻葉標準湯劑對照指紋圖譜的相似度。結果3批配方顆粒呈現與標準湯劑對照指紋圖譜保留時間一致的7個共有峰，3批配方顆粒（KL01、KL02、KL03）指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.999、0.999、0.999，表明3批顆粒與標準湯劑的整體相似度較高，質量與標準湯劑一致性較好。

圖4 3批羅布麻葉配方顆粒指紋圖譜

3 討論

本試驗羅布麻葉標準湯劑制備工藝參照《技術要求》和《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，選用合格的羅布麻葉飲片，以水為提取溶劑，通過對飲片用量、加水量、浸泡時間、煎煮時間、固液分離、濃縮工藝、冷凍干燥工藝等考察，并通過3批工藝驗證確定羅布麻葉標準湯劑制備工藝?？疾爝^程采用趁熱過濾的方式進行固液分離，過濾后放置在冷水中快速冷卻，同時采用低溫減壓濃縮及冷凍干燥等方法保證煎液質量的穩定，以最大限度與傳統湯劑保持一致。

2005年版《中國藥典》羅布麻葉項下收載了槲皮素的含量測定，2010、2015、2020年版《中國藥典》羅布麻葉項下含量測定指標為金絲桃苷。異槲皮苷、槲皮素是羅布麻葉降血壓的主要活性物質，異槲皮苷在羅布麻葉中含量較高且較穩定，因此，本研究在2020 年版《中國藥典》基礎上增加異槲皮苷為含量指標，以提升羅布麻葉配方顆粒質量標準。

本試驗建立了同時測定羅布麻葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量及指紋圖譜的方法。在方法建立過程中，采用DAD 檢測器進行全波長掃描，選取254、275、360 nm作為檢測波長進行比較，考察了不同流動相體系（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、流動相酸的種類（磷酸、甲酸、乙酸）、不同類型色譜柱[Waters CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）]、不同柱溫（33、35、37 ℃）及流速（0.28、0.30、0.32 mL/min）的影響，優選最佳色譜條件，并采用單因素分析法對供試品溶液制備的提取溶劑用量（25、50、100 mL）、提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流）及提取時間（30、60、90、120 min）進行考察，確定最佳供試品前處理方法。

本研究共收集6個省份共19批羅布麻葉藥材，根據標準湯劑的三大指標（出膏率、有效成分含量及轉移率、指紋圖譜），制定了羅布麻葉配方顆粒的各指標限度，為羅布麻葉配方顆粒生產工藝的研究提供依據。19批羅布麻葉標準湯劑出膏率、指標性成分的轉移率數據都比較穩定，指標性成分的含量與藥材、飲片的含量相關性較大，19批羅布麻葉標準湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.990，表明不同產地的羅布麻葉標準湯劑質量具有較高的一致性。采用UPLC建立的羅布麻葉標準湯劑質量控制參數基本反映了羅布麻葉藥材和飲片的質量屬性，能夠為羅布麻葉配方顆粒質量標準的制定提供依據。3批羅布麻葉配方顆粒出膏率、有效成分含量及轉移率、指紋圖譜的相似度均與標準湯劑的指標相一致，表明羅布麻葉配方顆粒的生產工藝符合要求，可為羅布麻葉配方顆粒質量標準的建立提供參考。