超高效液相色譜-三重四級桿質譜法檢測烏雞白鳳丸中鹿角膠特征肽及牛皮源成分

黃飛燕，李曉君，張國昌，李榮瑋，黃曉燕

1.滇西科技師范學院，云南 臨滄 677000；2.孟定海關綜合技術中心，云南 臨滄 677000；3.湖南省藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001

烏雞白鳳丸由烏雞、白芍、鹿角膠等二十味藥組成，作為治療婦科類疾病的重要藥物之一，主要功效主要有補氣養(yǎng)血、調經止帶，用于治療氣血兩虛、腰膝酸軟、崩漏帶下等癥［1］。《中國藥典》2020 年版一部中對該藥的質量標準進行了規(guī)定，其藥用成分由烏雞、白芍、鹿角膠等二十味藥組成。藥典中所記錄的烏雞白鳳丸的質量標準中暫時沒有無膠類原料成分的檢測方法，而膠類原料因來源有限，制作工序復雜，價格一直居高不下。很多不法商家以摻偽、造假等獲取不法暴利的問題十分突出，既損害了消費者的利益、影響其身心健康，也不同程度擾亂了含膠類藥品市場。因此，要保障消費者的切身利益，就必須確保含膠類藥品的質量。作為主要藥用成分之一，膠類由何種動物皮熬制而成和含量的多少是影響藥效、藥價成本的重要指標。為了準確評價市售烏雞白鳳丸的質量標準，建立一套檢測烏雞白鳳丸中膠類成分來源及成分含量的標準，實現對膠類成分的專屬性和可控性檢測評價，符合現實需求、十分必要且意義重大。

為了保證含鹿角膠類藥品的質量及提高檢測的專屬性，國家先后出臺了鹿角膠原料的鑒別［2］及補充檢驗方法［3-5］，但對于市售烏雞白鳳丸中是否添加鹿角膠成分，添加的含量為多少，現有能查到和借鑒的文獻較少，為補充完善烏雞白鳳丸中鹿角膠成分專屬性檢測方法，本研究在參考鹿角膠測定及牛皮源檢測的有關文獻［6-11］的基礎上，隨機采集市售2 個廠家5 批次的烏雞白鳳丸樣品，運用超高效液相色譜-三重四級桿質譜（UPLC-QQQ/MS）分析檢測技術，以鹿角膠特征肽為標志物進行定性和定量分析檢測，分析測定了樣品中的鹿角膠特征肽及牛皮源成分，該檢測方法可為含鹿角膠類藥品的質量控制及藥品監(jiān)管提供技術參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析天平（梅特勒-托利多XSE 205）；超聲波清洗器（新芝SBL-30DT）；液相色譜質譜聯用儀（戴安Ultimate 3000-TSQ）。

1.2 試藥

對照藥材：黃明膠（批號121695-201802）、鹿角膠（批號121694-201702），購自中國食品藥品檢定研究院。市售烏雞白鳳丸樣品隨機購買自某藥房（廠家A，批號20201070、20201266、20 201075；廠家B，批號20200801、20200802）；陰性樣品按處方自行制備。胰蛋白酶（質譜級），乙腈（色譜純），水（超純水），其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18（2.1 mm ×75 mm，1.7 μm），樣品進樣體積：5 μL，色譜柱柱溫：30 ℃；流動相組成：乙腈（A），0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫條件：0～6 min，5%→7% A，6～8 min，7%→90%A，8～15 min，90% A，15～20 min，90%→5% A，流速：0.3 mL/min。

2.2 質譜條件

采用ESI+模式進行數據采集，毛細管電壓設定為3 100 V，離子源溫度設定為100 ℃，在350 ℃下進行去溶劑化，鞘氣流速600 L/h，以MRM 模式進行掃描。設定鹿角膠特征分子離子峰m/z 765.4（雙電荷）→554.0、733.0，黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3（雙電荷）→726.2、783.3 為檢測離子對，碰撞能量分別為16 V 和20 V，按上述檢測離子對測定的MRM 色譜峰的信噪比均應大于3∶1。

2.3 供試品溶液的制備

取烏雞白鳳丸原藥約2 g（相當于含鹿角膠約0.1 g），精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氫銨溶液45 mL，置于超聲波儀中超聲提取30 min，中間間隔10 min，重復提取2 次，超聲完成后補加1%碳酸氫銨溶液定容至刻度線，充分搖勻后經0.22 μm 的微孔濾膜過濾，移取其中濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（配制方法：取質譜級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成濃度為1 mg/mL 的溶液，使用時配制），混合均勻后置于37 ℃下恒溫酶解12 h，由此制得供試品溶液。

2.4 鹿角膠對照藥材溶液的制備

取鹿角膠對照藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，按照“2.3”項所列方法制成對照藥材溶液。

2.5 牛皮源成分參比溶液的制備

取黃明膠對照藥材0.1 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氫銨溶液45 mL，超聲提取60 min，補加1%碳酸氫銨溶液至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 mL 轉移至50 mL 容量瓶中，用“2.4”項下鹿角膠對照溶液稀釋至刻度，按照“2.3”項所列方法制成牛皮源參比溶液。

2.6 陰性樣品溶液制備

根據2020 年版《中國藥典》2020 年版描述的烏雞白鳳丸處方組成，按比例準確稱取不含鹿角膠的陰性樣品，依照“2.3”項制備方法制成陰性樣品溶液。

2.7 鹿角膠鑒別的方法學考察

2.7.1 專屬性試驗精密吸取鹿角膠對照藥材溶液、陰性樣品對照溶液和供試品溶液（廠家B，批號20200801）各5 μL，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，以鹿角膠特征分子離子峰m/z 765.4（雙電荷）→554.0、733.0 作為檢測離子對通過進行分析測定。比較供試品鹿角膠特征色譜峰保留時間（7.86 min、7.87 min）和對照藥材品鹿角膠特征色譜峰保留時間（7.85 min、7.87 min）得出二者保留時間一致，而陰性樣品在相同保留時間位置沒有出現相應色譜峰，由此可以表明其他藥材成分對測定結果無干擾，從而證明該檢測方法專屬性強，相關圖譜結果見圖1。

圖1 不同溶液中鹿角膠特征離子色譜圖：A.對照藥材溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液

2.7.2 穩(wěn)定性試驗采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，依次對配制后0 h、6 h、12 h、24 h 相同批號供試品（廠家B，批號20200801）進行分析測定。根據鹿角膠特征分子離子峰m/z 765.4（雙電荷）→554.0 提取的供試品離子流色譜中，放置不同時間的供試品中鹿角膠特征色譜峰峰面積的RSD 為5.8%，由此可判斷供試品在配制后24 h 內基本穩(wěn)定。

2.7.3 重復性試驗取相同批號（廠家B，批號20200801）烏雞白鳳丸樣品6 份，按照“2.3”項所列方法分別制備供試品溶液并依次進行分析測定，結果顯示6 份供試品在相同保留時間（7.85 min、7.87 min）均出現了與對照品藥材相應的鹿角膠特征色譜峰，由此可知供試品滿足重復性實驗。

2.7.4 檢出限將制備好的鹿角膠對照藥材溶液，用烏雞白鳳丸陰性樣品溶液依次逐級稀釋，以鹿角膠特征分子離子峰m/z 765.4（雙電荷）→554.0 作為檢測離子對，按照信噪比為3∶1 計算檢出限，求得鹿角膠最低檢出濃度約為0.02 mg/mL。

2.8 牛皮源成分檢查的方法學考察

2.8.1 專屬性試驗精密吸取黃明膠參比溶液、陰性對照樣品溶液和供試品溶液（廠家B，批號20200801）各5 μL，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，以牛皮源特征離子對m/z 641.3（雙電荷）→726.2、783.3 作為檢測離子對進行分析測定。把供試品和陰性對照樣品溶液色譜圖與參比溶液色譜圖進行對比，發(fā)現供試品和陰性對照樣品溶液色譜圖中在保留時間8.24 min 處沒有出現與參比溶液黃明膠特征色譜保留時間（8.24 min）相同的色譜峰。由此表明處方中其他藥材成分對測定結果無干擾，證明該方法專屬性強，相關圖譜結果見圖2。

圖2 不同溶液中牛皮源特征離子色譜圖：A.參比溶液；B.樣品溶液；C.陰性對照樣品溶液

2.8.2 線性關系準確稱取黃明膠對照藥材約0.4 g，放置于200 mL 容量瓶中，加入160 mL 1%碳酸氫銨溶液，經超聲波處理60 min，補加1%碳酸氫銨溶液至刻度，充分搖勻備用。分別精密吸取上述黃明膠溶液2.5、5、10、15、25 mL，置于編號為1-5 號50 mL 量瓶中，準確稱量5 份鹿角膠對照藥材0.1 g，分別加入5 個容量瓶中，再分別加入適量1%碳酸氫銨溶液，超聲處理60 min 使溶解，補加1%碳酸氫銨溶液至刻度，充分搖勻備用，由此制得分別含0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/mL 黃明膠的不同濃度溶液（約相當于鹿角膠對照藥材樣品中摻入質量比為5%、10%、20%、30%、50%的黃明膠），按照相同的方法進行分析測定。以黃明膠特征色譜峰峰面積數值為縱坐標，以摻入黃明膠的量為橫坐標繪制標準曲線，黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3（雙電荷）→726.2 檢測離子對的回歸方程：Y=1.06×105X+41 586，r=0.995 3，由此得出含黃明膠溶液在0.1～1.0 mg/mL 濃度范圍內，滿足良好的線性關系。

2.8.3 精密度試驗準確吸取黃明膠牛皮源參比溶液5 μL，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，以m/z 641.3（雙電荷）→726.2 作為檢測離子測定峰面積，平行測定6 次，其峰面積的RSD 為1.5%，表明儀器的精密度良好。

2.8.4 穩(wěn)定性試驗采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，依次對配制后的0 h、6 h、12 h、24 h 黃明膠參比溶液進行依法測定。以m/z 641.3（雙電荷）→726.2 作為檢測離子分別測定不同時間的黃明膠參比溶液特征峰峰面積，放置不同時間的黃明膠參比溶液特征峰峰面積的RSD 為2.2%，由此可判斷黃明膠參比溶液在配制后24 h 內基本穩(wěn)定。

2.8.5 重復性試驗取相同批號（廠家B，批號20200801）烏雞白鳳丸樣品6 份，按照“2.3”項所列方法分別制備供試品溶液并依次進行分析測定，6 份供試品均出現與溶液在參比溶液色譜相應的色譜出峰位置出現了相應的色譜響應，計算6 份樣品峰面積值RSD 為4.5%，由此可知供試品滿足重復性實驗。

2.8.6 檢出限將制備好的黃明膠對照藥材溶液依次逐級稀釋，以黃明膠特征分子離子峰m/z 641.3（雙電荷）→726.2 作為檢測離子對，按照信噪比為3∶1 計算檢出限，求得黃明膠最低檢出濃度約為0.01 mg/mL。

2.9 樣品測定結果

按照“2.3”項下方法，分別將采集的2 個生產廠家的5 個批次烏雞白鳳丸樣品制成供試品溶液，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，分別對其中鹿角膠及牛皮源成分進行分析測定。結果顯示2個生產廠家的5 個批次烏雞白鳳丸樣品中均檢出鹿角膠特征肽，5 個批次烏雞白鳳丸樣品均檢出牛皮源成分，但因樣品中牛皮源成分特征峰峰面積均低于參比溶液峰面積，可視為未檢出。

3 討論

3.1 限度的擬定

在實驗過程中，為排除在樣品制取過程中因客觀原因混入少量牛皮源的情況，需要對牛皮源成分的檢出比例進行合理規(guī)定。按照2020 年版《中國藥典》2020 年版第四部中“附錄0212 藥材和飲片檢定通則”、國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（編號2012001、2014013、2014014）中的有關規(guī)定，結合實際需要，可以將烏雞白鳳丸中牛皮源成分檢查的限度設定為5%，即檢測結果中如果牛皮源成分特征峰峰面積與參比溶液峰面積差比值小于或等于5%，由此可判定為檢測的樣品中不存在牛皮源摻偽，反之，則判定檢測的樣品中存在牛皮源摻偽。

3.2 牛皮源測定結果的判定

對于牛皮源測定結果的影響因素，可以從儀器的生產廠家、型號、儀器的靈敏度等方面的差異來考慮，特別是當測試樣品中牛皮源成分含量恰好處于儀器檢測限附近時，檢測結果就沒有實際比較意義。因此，在實際分析測定時，需要把供試品的測定結果與參比溶液測定結果進行比較分析，從而確保結果判定的科學性。綜合測定結果可以參照下列3 種情況進行判定：（1）供試品色譜圖中未出現參比溶液牛皮源特征色譜峰，判定供試品中未檢出牛皮源成分；（2）供試品色譜圖中出現參比溶液牛皮源特征色譜峰，但經過比較，二者峰面積差比值不超過5%，判定供試品中未檢出牛皮源成分；（3）供試品色譜圖中出現參比溶液牛皮源特征色譜峰，且其峰面積值與參比溶液峰面積差比值大于5%，判定供試品中檢出牛皮源成分。

3.3 樣品質量分析

按照設定的分析方法，通對本品的檢測結果顯示，采集的2 個廠家5 批次的烏雞白鳳丸5 批樣品均檢出鹿角膠且未檢出牛皮源成分。由此說明采集的上述5 批次的烏雞白鳳丸均符合國家藥品標準，不存在鹿角膠摻偽投料的情況。

3.4 檢測方法分析

本研究采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜，選擇鹿角膠特征肽特征分子離子峰m/z 765.4（雙電荷）→ 554.0、733.0 及牛皮源特征分子離子峰m/z 641.3（雙電荷）→726.2、783.3 作為檢測離子對，對經胰蛋白酶酶解處理后的烏雞白鳳丸供試品進行定性、定量分析測定，再通過計算和對比分析，判定烏雞白鳳丸中是否存在鹿角膠特征肽和牛皮源成分。所建立的分析檢測方法專屬性強，分析結果準確、可靠，能同時快速有效鑒別鹿角膠特征肽和牛皮源成分，對有效控制和監(jiān)管含鹿角膠藥材制劑的質量提供了參考。