柴胡疏肝散“異病同治”治療抑郁癥、失眠障礙及偏頭痛作用機制的網絡藥理學研究

劉 毅，李 菲，賈躍進，郝世飛

抑郁癥(depression disorder，DD)、失眠障礙(insomnia disorder，ID)和偏頭痛(migraine)都是神經系統常見疾病，可對人們身心健康造成很大的危害[1]，研究顯示，這些疾病常伴發為合并病[2]，并可相互誘發、促進，其發病機制存在關聯，臨床用藥也有交集[1，3-6]。盡管目前現代醫學對于這些疾病有多種可供選擇的藥物，但仍缺乏理想藥物[7-9]。中醫藥具有整體性以及多靶點、多途徑發揮作用的特點，臨床應用安全有效，因此，挖掘中醫藥可為抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的藥物治療提供思路與參考。

柴胡疏肝散出自《醫學統旨》，由柴胡、川芎、白芍、枳殼、陳皮、甘草、香附七味中藥組成，是疏肝理氣的代表方劑，臨床常用于治療包括神經系統、消化系統、循環系統、內分泌系統疾病在內的多種疾病[10]。其中神經系統疾病主要以抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛為主，臨床研究亦證實其安全有效[11-13]。此外中藥復方“異病同治”是通過多成分、多靶點、多通路而發揮作用，具有復雜網絡的特質[14]，因此，運用網絡藥理學方法可一定程度揭示其作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分、靶點搜集與方劑-藥物-成分-靶點網絡構建 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索柴胡疏肝散各藥物有效成分及相關靶點，并限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行篩選，將所得靶點在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。然后再以方劑、藥物、有效成分及相關靶點為節點，其相互關系為邊通過CytoscapeV3.6.1構建網絡。

1.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集 在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/#)數據庫中分別檢索“depression disorder”“insomnia disorder”和“migraine”以搜集疾病靶點。再取藥物有效成分靶點與各疾病靶點的交集，從而獲得柴胡疏肝散有效成分中直接作用于3種疾病的靶點，并利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖。

1.3 疾病-方劑-有效成分-交集靶點網絡和蛋白-蛋白互作(PPI)網絡構建 以疾病、方劑、有效成分以及所得3類交集靶點為節點，其相互關系為邊，使用Cytoscape構建疾病-方劑-有效成分-交集靶點網絡。再將3類交集靶點分別導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，限定物種為智人，并利用Cytoscape軟件構建PPI網絡，利用內置網絡分析功能限定節點度值篩選PPI網絡核心靶點。

1.4 基因本體(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 在Metascape(https://metascape.org/)數據庫平臺中導入3類交集靶點并分別進行GO生物過程、分子功能及細胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在線作圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制其富集氣泡圖。

1.5 核心成分和核心靶點分子對接 取疾病-方劑-有效成分-交集靶點網絡中節點度大于2倍中位數的核心有效成分和PPI網絡中節點度大于1.5倍中位數的核心靶點，利用PDB(http://www.rcsb.org/)及Zinc(http://zinc.docking.org/)數據庫分別獲得核心靶點和核心成分的3D結構，預處理后應用AutoDock vina分子對接，并在Pymol中可視化結果。

2 結 果

2.1 柴胡疏肝散有效成分、相關靶點搜集與方劑-藥物-成分-靶點網絡構建結果 通過檢索TCMSP數據庫及限定藥物OB、BBB、DL篩選有效成分(見表1)，經去重排除后，共搜集到柴胡疏肝散 95種有效成分，138個關聯靶點。其方劑-藥物-成分-靶點網絡構建如圖1所示，該網絡有241個節點、1 249條邊，通過分析該網絡，篩選節點度較大的有效成分和靶點，可見柴胡疏肝散中主要的有效成分為7-甲氧基-2-甲基異黃酮、芒柄花黃素、羅通定、β-谷甾醇、豆甾醇、川陳皮素等；主要靶點為PTGS2、ESR1、NOS2、AR、PPARG等。

表1 柴胡疏肝散主要有效成分基本信息

圖1 方劑-藥物-成分-靶點網絡(CHSGS為柴胡疏肝散；CH為柴胡；CX為川芎；BS為白芍；ZQ為枳殼；CP為陳皮；GC為甘草；XF為香附)

2.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結果 在GeneCards、OMIM數據庫中檢索各疾病并將所得疾病靶點篩選、合并、去重、規范，得到抑郁癥、失眠障礙和偏頭痛靶點分別為4 777個、994個、1 748個。將柴胡疏肝散的138個靶點分別與其取交集(見圖2)，得到柴胡疏肝散-抑郁癥交集靶點113個，柴胡疏肝散-失眠障礙交集靶點43個，柴胡疏肝散-偏頭痛交集靶點63個。

圖2 藥物-疾病交集靶點

2.3 疾病-方劑-成分-靶點網絡和PPI網絡構建結果 疾病-方劑-有效成分-交集靶點網絡構建詳見圖3。圖中包含213個節點、1 273條邊。利用Cytoscape分析網絡計算節點度，分別篩選出與各個疾病相關的節點度較大(DC>2倍中位數)的核心成分(見表2)。然后將3類交集靶點分別導入STRING數據庫，選定物種為智人，得出以靶點為節點，蛋白互作關系為邊的PPI網絡(見圖4)，其中柴胡疏肝散-抑郁癥的PPI網絡節點數為113個，邊數為875條，平均節點度為15.5，平均局部聚類系數為0.543；柴胡疏肝散-失眠障礙的PPI網絡節點數為43個，邊數為196條，平均節點度為9.12，平均局部聚類系數為0.697；柴胡疏肝散-偏頭痛的PPI網絡節點數為63個，邊數為341條，平均節點度為10.8，平均局部聚類系數為0.641，再通過Cytoscape分析3個PPI網絡，分別篩選節點度大于1.5倍中位數的靶點為核心靶點，具體核心靶點詳見表2。

圖3 疾病-方劑-成分-靶點網絡(CHSGS為柴胡疏肝散)

圖4 柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的PPI核心靶點網絡圖(A為柴胡疏肝散治療抑郁癥的PPI網絡；B為柴胡疏肝散治療失眠障礙的PPI網絡；C為柴胡疏肝散治療偏頭痛的PPI網絡)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結果 將2.2中的3類交集靶點分別導入Metascape中進行GO和KEGG通路富集分析，其中柴胡疏肝散-抑郁癥的GO富集分析共獲得1 503條結果，其中生物過程1 255條，分子功能149條，細胞成分99條，另外KEGG通路富集分析得到148條結果。由結果可得，生物過程包括突觸信號、對有毒物質的反應、細胞對激素刺激的反應、對銨離子的反應等；分子功能涉及神經遞質受體活性、G蛋白偶聯的胺受體活性、G蛋白偶聯的乙酰膽堿受體活性等；細胞成分則包括突觸后膜、多巴胺能突觸、受體復合體等；涉及主要通路包括：神經活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等。柴胡疏肝散-失眠障礙的GO富集分析共獲得649條結果，其中生物過程518條，分子功能78條，細胞成分53條，而KEGG通路富集分析得到39條結果。從結果來看，生物過程包括化學突觸傳遞、單胺運輸、細胞對激素刺激的反應、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對類固醇激素的反應等；分子功能涉及腎上腺素受體活性、激素結合、類固醇結合等；細胞成分則包括突觸膜的組成部分、多巴胺能突觸、受體復合體等；涉及主要通路則包括神經活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、雌激素信號通路等。柴胡疏肝散-偏頭痛的GO富集分析共獲得914條結果，其中生物過程741條，分子功能條108，細胞成分65條，此外KEGG通路富集分析得到82條結果。根據結果可得，生物過程包括：行為、突觸信號、單胺運輸、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、細胞對激素刺激的反應等；分子功能涉及腎上腺素受體活性、多巴胺結合、銨離子結合等；細胞成分則包括：突觸后膜、膜筏等；涉及主要通路包括：神經活性配體-受體相互作用、可卡因成癮、環磷酸腺苷(cAMP)信號通路等。然后限定P<0.01，最小計數為3，富集因子>1.5篩選結果，繪制富集氣泡圖，詳見圖5～圖8。再分別以疾病、交集靶點、通路為節點，其相互關系為邊構建網絡，以直觀表明三者關聯(見圖9)，據該網絡可知神經活性配體-受體相互作用通路極大可能是柴胡疏肝散治療3種疾病過程中都最為關鍵的通路，因此，可認為柴胡疏肝散最可能藉由此通路對這些疾病產生作用，其通路的具體機制詳見圖10。

圖5 柴胡疏肝散-抑郁癥的GO富集分析氣泡圖

圖6 柴胡疏肝散-失眠障礙的GO富集分析氣泡圖

圖7 柴胡疏肝散-偏頭痛的GO富集分析氣泡圖

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

圖9 疾病-靶點-通路關系圖

圖10 神經活性配體-受體相互作用通路機制

2.5 核心成分與核心靶點分子對接結果 核心成分與核心靶點分子對接結果均<-20.92 kJ/mol，可見其核心成分與核心靶點的組合在預測中都可形成穩定結構(見表2)。然后取每種疾病中核心成分與核心靶點對接分數最小(分數越小表示結構越穩定)的組合運用Pymol對其構象可視化，其中綠色部分為靶點，黃色部分為成分分子，粉色標記殘基，并顯示其名稱，黃色虛線為氫鍵，并標距離。詳見圖11。

表2 核心活性成分與核心靶點分子對接結果 單位：kJ/mol

圖11 抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛中對接最好的核心成分與核心靶點的分子對接構象

3 討 論

3.1 中醫理論 從“肝”論治 抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛分別屬于中醫學的“郁證”“不寐”“頭痛”范疇。《丹溪心法》記載：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉。故人身諸病，多生于郁”[15]。說明疾病發生的物質基礎是氣血的運行不暢，而“氣為血之帥”“氣行則血行”，可進一步得出氣的運行是疾病發生的最關鍵環節。另有“凡郁皆肝病也”之說，可見“肝”作為氣機運行的樞紐，其功能異常則會導致“氣郁”，從而發為各種疾病。加之現代人的生活壓力較大，生活節奏較快，情志往往不遂。情志不舒，肝氣郁滯，臟腑陰陽氣血失調發為郁證；情志不暢，氣機郁滯，營衛陰陽運行失常發為不寐；情志不調，氣血郁遏，不通則痛則發為頭痛。因此，這3種疾病總體而言都與“肝郁氣滯”密切相關，柴胡疏肝散疏肝解郁、活血止痛，可對抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛對證治療。

3.2 構建網絡篩選核心靶點與成分 綜合分析本研究構建的方劑-藥物-成分-靶點網絡與疾病-方劑-有效成分-交集靶點網絡得出的11種核心有效成分，其中成分A是具有多種功能的植物固醇，可激活細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)-環磷酸腺苷(cAMP)反應元件結合蛋白(CREB)等途徑而促進神經和突觸形成[16]，并可通過減少氧化應激和炎癥來保護大腦[17]，對于精神病癥狀，動物實驗證實植物固醇可升高γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽水平，降低多巴胺(DA)、丙二醛、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性[18]；成分羅通定是一種小檗堿，可作為腎上腺素能藥物、抗精神病藥物和多巴胺受體拮抗劑[19]；成分E是一種類黃酮物質，具有神經營養、保護作用，并且在動物模型中可發揮抗抑郁作用，此作用涉及血清素能、去甲腎上腺素能或多巴胺能系統的參與[20]；成分D是一種主要的植物甾醇，研究認為其有抗焦慮及鎮靜作用[21]，同時可抑制炎癥反應而發揮神經保護作用[22]；光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定、甘草果苷、光甘草輪、美迪紫檀素、芒柄花黃素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等成分都屬于甘草中的黃酮類[23]，此類物質被報道有抗抑郁、神經保護等作用[24]。通過分析PPI網絡得到柴胡疏肝散作用于3種疾病的24個核心靶點，其中MAPK1、MAPK8、MAPK14編碼MAP激酶，MAPK1是一種已知的與抑郁、焦慮相關的信號分子[25]，MAPK8在成人新生顆粒細胞中的排他性抑制可緩解焦慮、抑郁[26]，MAPK14則已被證實可被柴胡疏肝散通過對其調節作用而發揮抗抑郁作用[27]；有動物實驗證實小膠質細胞STAT3通過神經元巨噬細胞集落刺激因子介導的突觸活動調節與抑郁相關的行為，表明抑制小膠質細胞STAT3可能是抑郁癥的一種新的治療策略[28]；SIRT1被認為是抑郁癥的潛在基因靶標[29]；MMP已被證明在大腦的許多生理和病理過程中起著至關重要的作用，尤其是包括抑郁癥在內的多種精神病[30]；ESR1、AR分別編碼雌激素、雄激素受體，雌二醇水平的變化與認知、情緒調節和抑郁癥易感性的變化有關，而雄激素水平低的男性使用雄激素替代療法可改善抑郁癥[31]，前列腺癌男性的雄激素剝奪療法可導致抑郁癥[32]；MAOA、MAOB、ADRA2C、ADRA2A、DRD2、HTR3A、SLC6A4、CHRNA4、ACHE、OPRM1所編碼的蛋白包括腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿酯、mu阿片類受體、單胺氧化酶、5-羥色胺轉運蛋白、乙酰膽堿酯酶，參與調控涉及腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿酯等的神經遞質，而這些神經遞質參與睡眠-覺醒的調控、抑郁癥癥狀的調節以及偏頭痛的發生[33-34]；PTGS2編碼的環加氧酶可通過多種途徑發揮神經保護作用[35]；CREB1編碼的蛋白參與包括晝夜節律同步的多種細胞過程[36]，并與快速眼動(REM)睡眠在抑郁癥中的作用有關[37]。

3.3 富集分析預測機制 由GO富集分析可以看出柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙及偏頭痛的主要生物過程、分子功能和細胞成分都與以上所述神經遞質以及一些激素密切相關；而對于三者的通路則可以看出可能性最大的依然是神經活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等諸如此類通路。從分子對接結果可得，所有核心成分均可能與核心靶點形成穩定結構，將其進一步進行數據分析，可得柴胡疏肝散治療抑郁癥對接較好的核心成分有豆甾醇、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定等，對接較好的核心靶點有PTGS2、MMP9、DRD2、SIRT1等；柴胡疏肝散治療失眠障礙對接較好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素等，對接較好的核心靶點有MAOB、MAOA、DRD2等；柴胡疏肝散治療偏頭痛對接較好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素等，對接較好的核心靶點有SLC6A4、DRA2A、DRD2等。可將這些成分和靶點視為柴胡疏肝散治療這些腦病關鍵成分和關鍵靶點。

綜上所述，根據中醫理論以及網絡藥理學和分子對接的分析可以最終得出柴胡疏肝散治療抑郁癥、失眠障礙、偏頭痛的可能關鍵成分為β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黃素、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定，可能關鍵靶點為PTGS2、MMP9、SIRT1、MAOB、MAOA、DRD2、SLC6A4、DRA2A，即最可能通過胺類神經遞質發揮作用，其作用的主要通路則最可能是神經活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、血清素能突觸等。此結論可為進一步研究和臨床應用提供一定思路和參考。