天麻干預腦缺血后星形膠質細胞損傷的作用機制研究

顧衛衛，曹磊磊，施盈盈，朱 慧

天麻是一味常用而較名貴的中藥，臨床上廣泛應用于頭暈癥、神經衰退、血管神經性頭痛。近年來，天麻開始應用于治療缺血性腦卒中。缺血性腦卒中的發病原因為腦部血液供應障礙，是老年人最為多見的疾病之一，具有較高的致殘率及致死率。隨著社會的老齡化進展，缺血性腦卒中是其中一種比較高發和嚴重的慢性疾病，導致神經功能障礙以及不可逆轉的腦損傷。缺血性腦卒中損傷機制復雜，涉及能量代謝、鈣超載、自由基損傷、炎癥反應及細胞凋亡等。目前主要采用抗凝、溶栓、抗血小板以及神經保護治療中風[1-2]。現在很多人都熱衷于神經保護藥，因為保護神經的藥物能使大腦更能對抗中風引起的損傷。近年來越來越多的研究開始專注于傳統中藥，天麻就是其中一種受人們熱捧的傳統中藥，具有鎮靜、抗驚厥等多種藥理活性[3]。天麻所具有的神經保護作用備受研究者的關注[4-8]。在我國天麻用于治療缺血性腦卒中病人，療效確切，并能明顯改善病人的行為障礙[9]。前期研究發現，連續給予天麻28 d，可減小缺血性腦卒中大鼠的腦梗死面積，改善其行為學癥狀，降低凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的表達水平，所以推測天麻對缺血性腦卒中病人的保護作用可能與Cathepsin B-Caspase通路有關。本研究探討天麻對腦缺血后星形膠質細胞損傷是否具有直接保護作用及Cathepsin B-Caspase信號通路與天麻保護細胞的作用有無關聯。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥品與試劑 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量300 g左右，不超過±10%。天麻純度 98.0%，紅四氮唑(TTC)，水合氯醛，抗體：Anti-GFAP(Millipore)、β-actin(Sigma)、anti-CathepsinB(MILLIPORE)、Anti-Caspase-3(MILLIPORE)。

1.2 主要實驗儀器 自動加熱墊；電子天平；標準腦立體定位儀；電子顯微鏡；大鼠抓力測定儀；電泳儀；電泳槽；離心機；超聲細胞破碎儀；恒溫電熱水浴鍋。

1.3 溶液配制 天麻的配制：10 g天麻溶于500 mL生理鹽水，然后再稀釋成4 mg/mL，常溫保存。4%TTC：稱取TTC 4 g，加入蒸餾水中，定容至100 mL，存放于4 ℃。4%多聚甲醛溶液：稱取多聚甲醛80 g，50 ℃水浴，溶解于800 mL蒸餾水，待完全溶解后，加入磷酸緩沖鹽溶液，調節pH 值為7.2～7.4，蒸餾水定容至2 000 mL，4 ℃冷藏保存。

1.4 缺血再灌注模型的建立 麻醉大鼠，固定好，切開頸部，分離出右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，扎緊頸外動脈以及頸總動脈的近心端，用動脈夾夾住遠心端，然后在此中間部位剪一小口，插入尼龍線，松開動脈夾，慢慢地將尼龍線推進血管內8～19 mm，使得大腦中動脈缺血，缺血2 h后，將尼龍線去除，腦部血流再灌注。假手術組同樣經過以上過程但不插線。缺血再灌注28 d對大鼠進行行為學測試以及神經癥狀評分[10-13]。天麻持續治療28 d后，取大鼠大腦、小腦、低位腦干以及嗅球去除，然后冠狀切為5片，每片厚度一致。然后用TTC染色，37 ℃避光染色30 min。染色完畢之后，再將腦片放入4%甲醛固定，固定完后取出腦片吸干或晾干，紅色的為正常組織，白色的為缺血壞死組織，拍照，使用SigmaScan Pro 5軟件分析缺血梗死體積，腦梗死體積=梗死腦組織體積/右腦體積。

1.5 分組方法及指標檢測

1.5.1 蛋白免疫印跡(Western Blot)法測定大鼠大腦皮層膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、Cathepsin B、Caspase-3表達 選取50只健康雄性大鼠，隨機分為假手術組、模型組、天麻低劑量(50 mg/kg)組、天麻中劑量(100 mg/kg)組、天麻高劑量(150 mg/kg)組，每組10只。天麻各劑量組和模型組均進行缺血再灌注手術，模擬人的缺血性腦卒中，假手術組進行假手術，不插線，其他操作都相同。天麻各劑量組每天給大鼠灌胃1次，天麻連續給藥28 d，模型組灌胃同體積溶劑。天麻連續給藥28 d后，取缺血區腦組織，Western Blot法檢測各組GFAP及凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3表達水平。

1.5.2 天麻對氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)誘導的星形膠質細胞乳酸脫氫酶(LDH)的影響 細胞培養板中接種上星形膠質細胞，為了觀測天麻對正常培養的星膠細胞生長有無影響，除了OGD/R組給予天麻處理外，正常培養組也給予相應的天麻處理，總共分為8組，分別為對照組(non-OGD組)、non-OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、non-OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、non-OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組、OGD/R組[氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)2 h，再給予正常培養基，恢復供氧]以及OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組，每組有3個復孔。給藥要求提前0.5 h，OGD處理時以及更換培養基時給予相應劑量的天麻。OGD/R結束后，細胞損傷程度測定采用LDH法。

1.5.3 Western Blot法測定OGD/R誘導的星形膠質細胞中GFAP、Cathepsin B、Caspase-3表達變化 原代培養的星膠細胞分為non-OGD組、non-OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、non-OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、non-OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組、OGD/R組以及OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組。給藥提前0.5 h，OGD處理時以及更換培養基時給予相應劑量的天麻。OGD/R結束后，采用Western Blot法檢測各組GFAP、Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 天麻對缺血再灌注大鼠行為學神經癥狀的影響

2.1.1 神經癥狀評分 模型組神經癥狀評分為(3.00±0.67)分，天麻低、中、高劑量組神經癥狀評分分別為(2.90±0.57)分、(2.80±0.63)分、(2.40±0.52)分。天麻高劑量組神經癥狀評分低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

2.1.2 抓力測試 模型組前肢抓力(90.87±13.07)g，假手術組前肢抓力(175.72±4.17)g，模型組前肢抓力明顯低于假手術組(P<0.01)。天麻低、中、高劑量組前肢抓力分別為(92.36±11.19)g、(102.97±12.12)g、(108.45±13.55)g，天麻中、高劑量組前肢抓力高于模型組(P<0.01)。詳見圖1。

2.1.3 圓桶測試 圓桶測試按右前肢的使用次數占總使用次數的百分比計算，模型組圓桶測試值為0.81±0.12，假手術組圓桶測試值為0.01±0.06，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。天麻低、中、高劑量組圓桶測試值為分別為0.80±0.08、0.74±0.11、0.68±0.08，天麻高劑量組圓桶測試值明顯低于模型組(P<0.05)。詳見圖1。

與假手術組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.2 天麻對缺血性再灌注大鼠腦梗死體積的影響 模型組腦梗死體積為(52.66±2.39)%，天麻低、中、高劑量組腦梗死體積分別為(38.61±1.89)%、(28.48±3.80)%、(14.95±1.34)%，與模型組相比，天麻低、中、高劑量組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)。詳見圖2、圖3。

圖2 各組TTC染色的切片圖(A為假手術組；B為模型組；C為天麻低劑量組；D為天麻中劑量組；E為天麻高劑量組。白色為缺血壞死部分)

與模型組比較，＊P<0.01。

2.3 天麻對缺血再灌注誘導的皮層缺血區及OGD/R誘導的星形膠質細胞中GFAP、LDH的影響 Western Blot檢測結果顯示，模型組 GFAP蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)，天麻中、高劑量組GFAP蛋白表達高于模型組(P<0.01)。在體外試驗中，OGD/R組GFAP蛋白表達明顯低于non-OGD組(P<0.01)，OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組GFAP蛋白表達明顯高于OGD/R組(P<0.01)。LDH漏出率升高，代表細胞受到損傷，即LDH值越高，細胞損傷程度越高。為了證明天麻對缺血腦細胞的保護作用，特別是缺血星形膠質細胞的保護作用，采用LDH法測定OGD/R 24 h 后LDH漏出率。與正常培養的細胞相比，OGD/R組 24 h LDH漏出率明顯升高。隨著給藥劑量的增加，LDH漏出率逐漸降低，OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組LDH漏出率低于OGD/R組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖4、圖5。

與假手術組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.4 天麻對缺血再灌注誘導的大腦皮層缺血區Cathepsin B、Caspase蛋白表達的抑制作用 Western Blot檢測結果顯示，模型組缺血區Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平明顯高于假手術組(P<0.01)，天麻低、中、高劑量組大腦皮層缺血區Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平均低于模型組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖6、圖7。

與假手術組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

與假手術組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.5 天麻對OGD/R 誘導的凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的影響 non-OGD組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平較低，但經OGD/R處理后，與這兩種凋亡蛋白明顯激活，OGD/R組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達較non-OGD組明顯升高(P<0.01)，OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達明顯低于OGD/R組(P<0.05或P<0.01)，提示天麻(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)可有效地降低OGD/R誘導的星形膠質細胞中Cathepsin B、Caspase-3的蛋白表達。詳見圖8、圖9。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.05，△P<0.01。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.01。

3 討 論

缺血性腦卒中是嚴重的致殘和致死疾病，會引起嚴重的腦損傷以及行為學障礙。有文獻報道，在大鼠大腦創傷性損傷模型以及心肌缺氧缺血模型中，長期給予天麻，能改善行為學癥狀，明顯減小壞死灶體積[14]，也有文獻報道天麻可以明顯地抑制繼發性炎癥[15]。以往研究著重于缺血急性期的大腦病理學變化，但現在開始關注缺血的亞急性期或者更長的一段時間[16-17]。缺血引起的水腫一般發生在急性期內，但腦體積縮小或者萎縮一般會經歷較長的一段時間，這個觀點在目前的研究中也得以證實。缺血再灌注后，長期給予天麻，可明顯改善大鼠行為學癥狀，兩前肢得以平衡使用，且明顯增強前肢抓力力度，通過染色統計分析，白色梗死體積明顯縮小，提示對于缺血性腦損傷模型，天麻具有腦保護作用。但是其具體的作用機制尚未明確。武海云等[18]研究證實，天麻素可以通過抑制腦缺血大鼠大腦皮質細胞中 p38 蛋白磷酸化水平，降低磷酸化及抑制活性 Caspase-3蛋白表達，Caspase-3能催化許多關鍵蛋白的裂解，細胞凋亡壞死時，其常被激活。高濃度谷氨酸能夠激活Caspase-3蛋白的表達，武海云等[18]的實驗中谷氨酸處理組Caspase-3蛋白激活，給予天麻素72 h后Caspase-3蛋白表達量與谷氨酸處理組相比明顯降低，提示天麻素可抑制谷氨酸誘導的凋亡，其機制可能與Caspase-3依賴性途徑發生的凋亡相關。基于以上的理論基礎及研究進展，在大鼠的腦缺血再灌注模型以及細胞的OGD/R模型上觀察天麻對星形膠質細胞的保護作用，及其對Cathepsin-caspase 信號通路的影響。本實驗研究證明，大鼠腦缺血再灌注以后，溶酶體酶Cathepsin B以及Caspase-3表達明顯升高，天麻能有效地降低溶酶體酶Cathepsin B以及Caspase-3的表達水平。同時在體外試驗中也證實了天麻對Cathepsin B、Caspase-3激活的抑制作用。本實驗證實了天麻對缺血性腦卒中的治療療效，且通過體外體內模型試驗，闡明天麻可能通過抑制Cathepsin B Caspase的細胞凋亡途徑，從而對損傷的腦細胞發揮保護作用，為缺血性腦卒中疾病的治療提供了潛在的藥物靶點。