缺血性腦卒中病人血清miR-181a表達(dá)水平與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系

劉 麗，牛曉露，常 利，朱巖巖，李合華

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)多好發(fā)于中老年人群，隨著我國(guó)老年化進(jìn)程的加速，缺血性腦卒中發(fā)病率呈現(xiàn)日益上升趨勢(shì)，年均增長(zhǎng)率在8.3%左右[1]。缺血性腦卒中后可伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙，部分病人可進(jìn)展為癡呆，流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，腦卒中后認(rèn)知功能障礙及癡呆患病率分別為80.97%和48.91%[2]。然而，目前缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于一種非編碼RNA，miRNA表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)與缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，急性腔隙性腦梗死病人血清miR-29c-3p水平降低，而miR-191-5p和miR-20a-5p水平升高，且均與認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[5-6]。miR-181a長(zhǎng)度為110 bp[7]，目前關(guān)于缺血性腦卒中病人血清中miR-181a表達(dá)水平尚不清楚，本研究分析缺血性腦卒中病人血清miR-181a表達(dá)水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性，為尋找評(píng)估缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的潛在生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年3月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的168例缺血性腦卒中病人，根據(jù)是否發(fā)生認(rèn)知功能障礙分為認(rèn)知功能障礙組(73例)和非認(rèn)知功能障礙組(95例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①缺血性腦卒中病人經(jīng)頭顱磁共振成像(MRI)或CT檢測(cè)確診，缺血性腦卒中診斷符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]中的具體診斷標(biāo)準(zhǔn)；②缺血性腦卒中病人發(fā)病前無(wú)認(rèn)知功能障礙；③能完成常規(guī)保守治療；④具備小學(xué)及小學(xué)以上文化程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在腦出血、腦血管畸形及顱內(nèi)占位性病變等病人；②精神障礙性疾病病人；③住院期間合并難以控制的危急重癥；④腦卒中后抑郁、失語(yǔ)等影響各種量表評(píng)定病人；⑤失訪病人。認(rèn)知功能障礙評(píng)估：治療結(jié)束3個(gè)月后，對(duì)所有缺血性腦卒中病人進(jìn)行門診或電話隨訪，采用中文版簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表(Mini Mental State Examination，MMSE)[9]評(píng)估認(rèn)知功能，MMSE主要從定向、回憶、計(jì)算、語(yǔ)言、復(fù)述、執(zhí)行功能與命名7個(gè)維度進(jìn)行評(píng)估，回答錯(cuò)誤或不知道計(jì)0分，回答正確計(jì)1分，滿分30分，MMSE得分<26分為異常。MMSE得分越低，說明認(rèn)知功能越低，根據(jù)MMSE評(píng)分分為重度認(rèn)知功能障礙組(MMSE評(píng)分≤10分)、中度認(rèn)知功能障礙組(MMSE評(píng)分11～19分)和輕度認(rèn)知功能障礙組(MMSE評(píng)分20～25分)。認(rèn)知功能障礙組與非認(rèn)知功能障礙組病人一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，詳見表1。本研究中所有的研究對(duì)象均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書。

表1 認(rèn)知功能障礙組與非認(rèn)知功能障礙組病人一般資料比較

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 血清中miR-181a表達(dá)水平的檢測(cè) 入院后于清晨空腹抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血5 mL并離心取上層血清，立即將血清轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管中并置入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol法提取所有研究對(duì)象血清中總RNA，濃度采用A260/A280比值表示，當(dāng)比值為1.8～2.2時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。miR-181a和內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成(見表2)。根據(jù)miScript II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(QIAGEN公司，德國(guó))，反應(yīng)體系：miScriptHispct(5x)4 μL，miScriptNucleics(10x)2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA模板12 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 50 min，95 ℃ 8 min，最后加入80 μL雙蒸水(ddH2O)水稀釋。采用miScript SYBR Green試劑盒進(jìn)行miR-181a定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)(QIAGEN公司，德國(guó))，反應(yīng)體系：SYBR Green I 混合液10 μL，U6正向引物和反向引物各0.25 μL，cDNA 6 μL，無(wú)RNA酶水3 μL。反應(yīng)條件：預(yù)加熱95 ℃，30 min，變性94 ℃，15 s，退火55 ℃，30 s，延伸70 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。Ct值為反應(yīng)孔的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，血清中miR-181a的相對(duì)表達(dá)量為2-△Ct=CtmiR-181a-CtU6。

表2 miR-181a和U6引物序列(5′-3′)

1.2.2 血清NSE和S-100β表達(dá)水平的檢測(cè) 入院后于清晨抽取所有研究對(duì)象空腹外周靜脈血5 mL于試管中，靜置10 min后離心，取上層血清保存到新的EP管中，放入-80 ℃冰箱中保存。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和S-100β表達(dá)水平均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(中國(guó))。所有檢測(cè)操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 認(rèn)知功能障礙組與非認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平及MMSE評(píng)分比較 與非認(rèn)知功能障礙組相比，認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平均明顯升高，而MMSE評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表3。

表3 兩組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平及MMSE評(píng)分比較

2.2 認(rèn)知功能障礙各亞組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平比較 輕度認(rèn)知功能障礙組、中度認(rèn)知功能障礙組和重度認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與輕度認(rèn)知功能障礙組、中度認(rèn)知功能障礙組相比，重度認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，重度認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平明顯高于中度認(rèn)知功能障礙組(P<0.05)。詳見表4。

表4 認(rèn)知功能障礙各亞組血清miR-181a、NSE和S-100β表達(dá)水平比較

2.3 認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a與NSE、S-100β和MMSE評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-181a與NSE呈正相關(guān)(r=0.514，P<0.05)，與MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.336，P<0.05)，而與S-100β無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.223，P=0.087)。

2.4 血清miR-181a表達(dá)水平在診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的ROC曲線 繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miR-181a診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的曲線下面積(AUC)為 0.889[95%CI(0.826，0.951)]，當(dāng)取最佳截?cái)嘀禐?.14時(shí)，診斷敏感度和特異度分別為90.5%和84.2%。詳見圖1。

圖1 血清miR-181a診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的ROC曲線

3 討 論

認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響缺血性腦卒中病人生活質(zhì)量，增加再住院和死亡風(fēng)險(xiǎn)，年齡、教育程度、載脂蛋白E基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥等均是腦卒中后認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素[10]。目前，缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙具體機(jī)制尚不清楚。miRNA屬于一種非編碼RNA，主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化及增殖等多種生物學(xué)功能，miRNA在體內(nèi)血清中表達(dá)穩(wěn)定，易于檢測(cè)[11]，miR-181a屬于一種功能性miRNA，研究顯示，miR-181a與缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制有關(guān)[12-13]。本研究分析缺血性腦卒中病人血清中miR-181a表達(dá)水平及其與缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。

MMSE量表是國(guó)內(nèi)常用于篩查認(rèn)知功能障礙的量表，信度和效度均較高，國(guó)外研究顯示缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙發(fā)病率為24%～39%[14-15]，而我國(guó)長(zhǎng)沙一項(xiàng)隊(duì)列研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙發(fā)病率為41.8%[16]。本研究通過對(duì)缺血性腦卒中病人進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率為43.45%(73/168)，與非認(rèn)知功能障礙組相比，認(rèn)知功能障礙組血清miR-181a表達(dá)水平明顯升高，且與認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，提示miR-181a可能在缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了一定作用。miR-181a屬于一種典型的多功能miRNA，參與了細(xì)胞增殖、分化、免疫炎癥等多種細(xì)胞生物學(xué)過程，與腫瘤[17]、阿爾茨海默病[18]等多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-181a與缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。呂燕妮等[19]通過生物信息學(xué)方法證實(shí)，miR-181a與多種轉(zhuǎn)錄因子相互調(diào)節(jié)相互作用，在腦卒中發(fā)病機(jī)制中的多種復(fù)雜因子構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)干擾miR-181a表達(dá)時(shí)，下游炎癥信號(hào)通路中NF-κB p65受體受到明顯抑制，說明miR-181a可能通過炎性因子NF-κB介導(dǎo)腦卒中的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)Moon等[20]發(fā)現(xiàn)當(dāng)拮抗miR-181a后能明顯減少大鼠腦梗死灶體積和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失。Ouyang等[21]在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)miR-181a表達(dá)水平上調(diào)后會(huì)加重缺血性腦卒中病情的發(fā)生發(fā)展。主要與miR-181a上調(diào)后明顯降低GRP78蛋白的表達(dá)有關(guān)，而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)屬于熱休克蛋白之一，同時(shí)也是反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一項(xiàng)標(biāo)志性蛋白，GRP78低表達(dá)會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，細(xì)胞凋亡通路被啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞缺血死亡[22]。紅花注射液治療缺血性腦卒中療效明顯，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅花注射液干預(yù)后會(huì)明顯縮小缺血性腦卒中小鼠腦梗死面積和降低神經(jīng)損傷評(píng)分，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腦組織中GRP78 mRNA表達(dá)上調(diào)[23]。目前，關(guān)于miR-181a與缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的研究報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可反映缺血性腦卒中病人認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-181a屬于α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體介導(dǎo)的突觸可塑性和記憶機(jī)制中的一個(gè)負(fù)性調(diào)控因子，miR-181a可導(dǎo)致突觸功能障礙和記憶損傷，當(dāng)抑制miR-181a表達(dá)后能減少小鼠的記憶缺陷[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病病人血清中miR-181a表達(dá)水平上調(diào)，且與病人輕度認(rèn)知功能障礙有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-181a與各項(xiàng)異性分?jǐn)?shù)(FA)呈負(fù)相關(guān)[18]，而各項(xiàng)異性分?jǐn)?shù)與認(rèn)知功能障礙有關(guān)，頭顱磁共振擴(kuò)散張量成像顯示認(rèn)知功能障礙病人各項(xiàng)異性分?jǐn)?shù)明顯降低[25]。宋磊[26]也證實(shí)，當(dāng)干擾miR-181a表達(dá)后可抑制腦缺血-再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)。而過度炎癥反應(yīng)會(huì)加重腦缺血損傷，使得缺血性腦卒中病人更易發(fā)生認(rèn)知功能障礙[10，27]；另一方面，NSE和S-100β在腦組織細(xì)胞中的活性較高。本研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能障礙病人血清中NSE和S-100β表達(dá)水平明顯升高，且與認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度有關(guān)。蔡姝萍等[28]同樣發(fā)現(xiàn)，血清中NSE、S-100β表達(dá)水平越高，認(rèn)知功能障礙越嚴(yán)重，與本研究結(jié)果基本相一致，但本研究還發(fā)現(xiàn)miR-181a與NSE呈正相關(guān)，但與S-100β無(wú)明顯相關(guān)性。牛莉莉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中小鼠模型血清中NSE和S-100β表達(dá)水平明顯升高，且與梗死面積及神經(jīng)功能評(píng)分均呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示，miR-181a可能通過介導(dǎo)NSE的表達(dá)上調(diào)而參與缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-181a水平明顯升高，miR-181a水平升高是其作為缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的基礎(chǔ)，為探討血清miR-181a水平是否可作為診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的一項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物；ROC曲線分析后發(fā)現(xiàn)，miR-181a在診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的AUC為 0.889，當(dāng)取最佳截?cái)嘀?.14時(shí)，診斷敏感度和特異度分別為90.5%和84.2%。因此，血清miR-181a可作為缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的一項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙病人血清中miR-181a表達(dá)水平明顯升高，高表達(dá)的miR-181a與認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制可能相關(guān)，采用ROC曲線證實(shí)miR-181a診斷缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙的臨床效能較好。