不同凍干保護(hù)劑在外泌體儲存中的研究

吳穎杰，耿夢緣，汪晶，尹海芳

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院&醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，天津 300070）

外泌體因具有生物相容度高、免疫原性低/無、特定組織趨向性、可修飾性以及高穩(wěn)定性等優(yōu)勢[1-2]被作為天然的納米載體，廣泛應(yīng)用于藥物運(yùn)輸[3-4]和疾病診斷治療[5-7]等研究。

然而，外泌體的運(yùn)輸和長期儲存是限制其臨床應(yīng)用的重要因素。目前外泌體主要以-80℃儲存為主[8]，但是該方法的運(yùn)輸成本較高，臨床適用性差，因此，亟需開發(fā)一種更為有效的外泌體儲存方法。凍干技術(shù)具有保持物質(zhì)活性，防止其被氧化和加水易復(fù)原等優(yōu)勢，廣泛用于保存蛋白質(zhì)[9]、血清[10]和細(xì)胞[11]等生物物質(zhì)，并且可用于改善納米載體例如脂質(zhì)體等的穩(wěn)定性[12]。然而，凍干過程的極端環(huán)境會對外泌體造成破壞，因此，需要添加凍干保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)。鑒于此，本研究嘗試了包括賴氨酸、海藻糖、乳糖和菊糖在內(nèi)的凍干保護(hù)劑對外泌體完整性、分散性和生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 293T 細(xì)胞（購自ATCC 生物庫）、C2C12 細(xì)胞（天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)系傅力教授課題組贈送）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs，第4 代，天津醫(yī)科大學(xué)分子眼科實(shí)驗(yàn)室贈送）、DMEM高糖培養(yǎng)基（中國，allBio 公司）、青霉素/鏈霉素雙抗（美國，Gibco 公司）、胎牛血清（美國，AusGeneX）、2.5%戊二醛（中國，索萊寶）、甲基纖維素（美國，Sigma 公司）、多聚甲醛（美國，Sigma 公司）、兔源CD63多克隆抗體（美國，Santa Cruz 公司）、鼠源CD81 多克隆抗體（美國，Santa Cruz 公司）、HRP標(biāo)記羊抗兔抗體（中國，聯(lián)科生物）、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體（中國，聯(lián)科生物）、海藻糖（美國，Sigma 公司）、乳糖（美國，Sigma 公司）、賴氨酸（美國，Sigma 公司）、菊糖5000（中國，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）、0.22 μm 濾器（美國，Millipore 公司）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國，Thermo 公司）、基質(zhì)膠（中國，索萊寶）、Nanodrop2000c 核酸蛋白微量檢測儀（美國，Thermo 公司）、高速離心機(jī)（德國，Eppendorff 公司）、Avanti J-26XP 超速離心機(jī)（德國，Beckman 公司）、HT7700 透射電子顯微鏡（日本，日立高新技術(shù)公司）、DK-8D 恒溫水浴鍋（中國，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo 公司）、超凈工作臺（中國，AIRTECH 公司）、Alpha 1-4 真空冷凍干燥機(jī)及Christ 凍干機(jī)（德國，Christ 公司）、Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本，奧林巴斯公司）、NS300 納米粒徑分析儀（英國，Malvern 公司）、IX71 倒置熒光顯微鏡（日本，奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 293T 細(xì)胞培養(yǎng)及超速離心法提取細(xì)胞上清中外泌體 293T 細(xì)胞（2.5×106）加入10 mL 無外泌體的DMEM 培養(yǎng)基（含1%雙抗，10%FBS），于5%CO2、37℃下培養(yǎng)48 h。收取上清并分別以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min 后棄沉淀，再以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min 后棄沉淀。離心后的上清液通過0.22 μm 濾器得到濾液，以100 000 r/min 超速離心70 min，棄上清。加入適量的無菌DPBS 或等滲凍干保護(hù)液反復(fù)吹打超速離心管底部，得到293T 細(xì)胞外泌體重懸液。將外泌體重懸液以10 000 r/min 離心5 min，去除超離過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，回收外泌體重懸液待用。整個操作下均是在4℃下進(jìn)行。

1.2.2 等滲凍干保護(hù)劑的配制 見表1。為驗(yàn)證賴氨酸在凍干過程能否保護(hù)外泌體，向超離后的293T細(xì)胞來源的外泌體中分別加入等體積濃度依次為50、100 和200 mmol/L 賴氨酸，凍干后加入等體積去離子水重懸，電鏡下觀察外泌體形貌。選擇不同玻璃化溫度的糖類如乳糖（lactose）、海藻糖（trehalose）和菊糖（inulin），并測試它們在外泌體凍干過程中的保護(hù)作用。

表1 不同凍干保護(hù)劑的成分和配比Tab 1 Composition and ratio of different lyoprotectants

1.2.3 外泌體凍干及重懸 將新鮮制備的外泌體放入液氮中快速冷凍，使用冷凍干燥機(jī)以0.050 mPa及-56℃條件將外泌體樣品在真空中凍干12 h 后，并在室溫下儲存1 d～1 個月直至使用。在使用前，凍干后的外泌體用凍干前相同體積的水再水化。

1.2.4 醋酸鈾染色及透射電鏡表征 將等體積的4%多聚甲醛加入到外泌體重懸液，室溫下靜置20 min固定外泌體。取20 μL 固定后的外泌體置于Parafilm 封口膜上形成懸滴，再用鑷子將碳膜銅網(wǎng)的光亮面倒扣置于外泌體懸滴上，室溫下孵育20 min，使外泌體吸附到銅網(wǎng)上。隨后，將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移至100 μL DPBS 懸滴上孵育5 min，再轉(zhuǎn)移到100 μL 去離子水上繼續(xù)孵育5 min，接著將銅網(wǎng)置于100μL 1%戊二醛溶液上，室溫固定5 min；用100 μL 去離子水洗滌銅網(wǎng)，每次洗滌時間2 min，一共洗滌8 次；將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移至100 μL 草酸鈾溶液（4%乙酸雙氧鈾溶液和0.15 mol/L 草酸等體積配制，并調(diào)pH 為7）上，室溫染色5 min；將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移到100 μL 甲基纖維素-乙酸雙氧鈾溶液（4%乙酸雙氧鈾溶液和2%甲基纖維素體積比為1∶9 配制）上，放置冰上染色7 min；用濾紙快速吸去銅網(wǎng)上多余的溶液，最后將銅網(wǎng)置于濾紙上風(fēng)干，透射電鏡觀察形貌和分散性。

1.2.5 血漿外泌體誘導(dǎo)血管成管實(shí)驗(yàn) 將新鮮采集的人血加入抗凝劑EDTA 混勻，將血液于3 000 r/min離心30 min，取上清。將上清加入無菌DPBS 稀釋10 倍，將稀釋液以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min后棄沉淀，接著以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min后棄沉淀，再以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min 后棄沉淀。離心后的上清液通過0.22 μm 濾器得到濾液，以100 000 r/min 超速離心70 min，棄上清。加入適量的無菌DPBS 反復(fù)吹打超速離心管底部，得到293T細(xì)胞外泌體重懸液。將外泌體重懸液以10 000 r/min離心5 min，去除超離過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，回收外泌體重懸液待用。整個操作均是在4℃下進(jìn)行。將外泌體加入2%海藻糖凍干。將基質(zhì)膠以每孔300 μL 加入預(yù)冷的24 孔板中鋪勻，放入37℃培養(yǎng)箱中1 h 使其凝固。接著向每個孔中加入2.5×105個血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且加入50 μg 的外泌體，37℃培養(yǎng)4～6 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 外泌體的粒徑分析 將外泌體通過自動注射泵在納米顆粒跟蹤分析儀上測試，每個樣品分別記錄3 次60 s 時儀器測量值，并使用NTA3.3 軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 蛋白免疫印跡表征 將30 μg 外泌體加入至10%聚丙烯酰胺凝膠中分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶并在4℃下封閉2 h。將PVDF 膜按marker 蛋白剪成相應(yīng)大小條帶，將兔源CD63 多克隆抗體（美國，Santa Cruz 公司）、鼠源CD81 多克隆抗體（美國，Santa Cruz 公司）分別稀釋200 倍與相應(yīng)PVDF 膜孵育，在4℃搖床上孵育12 h，回收一抗。用5%脫脂牛奶清洗PVDF 膜，每次10 min，一共3 次。將HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體（中國，聯(lián)科生物）、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體（中國，聯(lián)科生物）的二抗稀釋5 000 倍，然后與相應(yīng)的PVDF 膜條帶孵育，于4℃搖床下孵育2 h，回收二抗。再用含有1‰吐溫-20的PBS 清洗3 次，每次10 min。最后向PVDF 膜滴加200 μL 發(fā)光液，壓片曝光成像。

1.2.8 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將C2C12 細(xì)胞以5×104個/孔接種到24 孔板的細(xì)胞爬片上，加入500 μL 去外泌體的10%FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。將10 μg 經(jīng)DiR熒光標(biāo)記的293T 外泌體加入24 孔板中，5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h，使C2C12 細(xì)胞充分?jǐn)z取外泌體。次日，加入500 μL DPBS 輕輕沖洗細(xì)胞3 次，去除死細(xì)胞，再加入200 μL 4%PFA 室溫固定30 min。最后將爬片取出，加入一滴含DAPI 的封片劑封片，避光風(fēng)干1 h，激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SigmaStat3.5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s 表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 賴氨酸作為凍干保護(hù)劑對外泌體的影響 在不加凍干保護(hù)劑的情況下，凍干后的外泌體發(fā)生破損，產(chǎn)生大量外泌體聚集體，外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，分散度差。在含有50、100 和200 mmol/L賴氨酸的凍干組中，外泌體呈現(xiàn)典型的杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，形貌較完整。另外，從分散性角度來看，不加凍干保護(hù)劑時，外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，產(chǎn)生大量外泌體聚集體，分散度較差。雖然賴氨酸作為凍干保護(hù)劑在一定程度上保護(hù)了外泌體形貌的完整，但與-80℃保存條件下的外泌體相比，賴氨酸未完全解決凍干導(dǎo)致的外泌體聚集和膜融合現(xiàn)象，見圖1。

圖1 賴氨酸作為凍干保護(hù)劑的外泌體的電鏡表征Fig 1 Electron microscopy characterization of exosomes with lysine as a lyoprotectant

2.2 糖類作為凍干保護(hù)劑對外泌體的影響 2%乳糖部分緩解了外泌體在凍干過程中發(fā)生的聚集現(xiàn)象，但是存在少量膜碎片，而4%乳糖和2%海藻糖作為凍干保護(hù)劑時外泌體分散較好，呈現(xiàn)雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)。乳糖對凍干外泌體的保護(hù)作用呈濃度依賴性。菊糖組外泌體分散良好，沒有出現(xiàn)膜融合現(xiàn)象，但是外泌體膜發(fā)生破損。進(jìn)一步比較了4%乳糖組和2%海藻糖組，可以看出兩組外泌體形貌差異不大，而2%海藻糖組外泌體的分散程度更高。最終選用2%海藻糖作為外泌體凍干保護(hù)劑進(jìn)行下游測試。2.3 血漿外泌體凍干后的功能測試 將血漿來源外泌體用2%海藻糖進(jìn)行凍干，結(jié)果顯示（圖3），凍干后的血漿外泌體仍然可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管，并且和-80℃組相比基本沒有差異。

圖2 乳糖、海藻糖和菊糖作為凍干保護(hù)劑的外泌體的電鏡表征Fig 2 Electron microscopy characterization of exosomes with lactose，trehalose and inulin as lyoprotectants

圖3 2%海藻糖用于凍干血漿外泌體的細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)Fig 3 2% trehalose for cell tube formation experiments of lyophilized plasma exosomes

2.4 凍干后不同儲存時間下的外泌體表征 電鏡結(jié)果顯示（圖4A、4B 和4C），凍干后常溫儲存1 d、1 周甚至1 個月的外泌體形貌依然完整，呈現(xiàn)典型的杯狀結(jié)構(gòu)，并且分散度良好、沒有聚集。納米顆粒跟蹤分析儀結(jié)果顯示（圖4D、4E），在儲存1 d 后，2%海藻糖凍干組外泌體與-80℃組外泌體粒徑分布沒有差異，而且兩組外泌體數(shù)量均沒有顯著性差異（F=28.8，P＞0.05），但是沒有加入海藻糖組的外泌體數(shù)量和另外兩組相比顯著降低（F=28.8，P＜0.001）。在儲存1 周后，2%海藻糖凍干組外泌體與-80℃組外泌體粒徑分布也沒有差異，而且兩組外泌體數(shù)量均沒有顯著性差異（F=88.8，P＞0.05），但是沒有加入海藻糖組的外泌體數(shù)量和另外兩組相比顯著降低（F=88.8，P＜0.001）。在儲存1 個月后，2%海藻糖凍干組外泌體與-80℃組外泌體粒徑分布亦無差異，而且兩組外泌體數(shù)量均無顯著性差異（F=136.9，P＞0.05），但是沒有加入海藻糖組的外泌體數(shù)量和另外兩組相比顯著降低（F=136.9，P＜0.001）。

圖4 分別儲存1 d、1 周和1 個月的外泌體表征Fig 4 Characterization of exosomes stored for 1 day，1 week，and 1 month

免疫印跡結(jié)果顯示（圖5A），加入2%海藻糖凍干處理后的外泌體，即使在常溫條件下儲存1 個月，依舊能有效防止儲存過程中外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81 被降解，而不加海藻糖的外泌體CD81 和CD63 蛋白都發(fā)生了降解，而且隨著時間的增加，降解越嚴(yán)重，到1 個月后CD81 和CD63 蛋白基本完全降解。凍干后的外泌體用DiR 熒光染料標(biāo)記并將其加入C2C12 細(xì)胞中，觀察能否被細(xì)胞攝取。共聚焦結(jié)果顯示（圖5B），與儲存在-80°C 下的外泌體相比，2%海藻糖凍干后儲存的外泌體顯示出相似的細(xì)胞攝取能力，而不加海藻糖組進(jìn)入細(xì)胞的外泌體較少。

圖5 2%海藻糖作為外泌體凍干保護(hù)劑時，不同儲存時間的外泌體功能測試Fig 5 Exosome function test at different storage time with 2%trehalose used as exosome lyoprotectant

3 討論

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑在30～150 nm 的天然生物納米囊泡，能夠以長、短距離的方式來運(yùn)輸功能性生物分子，是細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信使[13-15]。同時外泌體因具有生物相容度高、免疫原性低/無、特定組織趨向性、可修飾性以及高穩(wěn)定性等優(yōu)勢[1-2]被作為天然的納米載體，已廣泛應(yīng)用于藥物運(yùn)輸[3-4]和疾病診斷治療[5-7]等研究。然而，外泌體的運(yùn)輸和長期儲存是限制其臨床應(yīng)用的重要因素。目前外泌體以-80°C 儲存為主[8]，該方法運(yùn)輸成本較高，臨床適用性差，因此，亟需開發(fā)一種更為有效的外泌體儲存方法。凍干技術(shù)具有保持物質(zhì)活性，防止其被氧化和加水易復(fù)原等優(yōu)勢，廣泛用于保存蛋白質(zhì)[9]、血清[10]和細(xì)胞[11]等生物物質(zhì)，并且可用于改善納米載體例如脂質(zhì)體等的穩(wěn)定性[12]。然而，凍干會對生物樣品施加相當(dāng)大的壓力，因此，如果沒有得到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，外泌體等膜結(jié)合囊泡在冷凍干燥和再水化過程中會發(fā)生破損。目前常用的凍干保護(hù)劑（lyoprotectant）有甘露醇、甘油、二甲基亞砜、糖類（如海藻糖、蔗糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。

鑒于此，在本研究中，根據(jù)水置換[16]和玻璃化假說[17]保護(hù)理論評估了賴氨酸、乳糖、海藻糖和菊粉等凍干保護(hù)劑對凍干外泌體的影響。水置換假說提出非揮發(fā)性凍干保護(hù)劑分子（例如賴氨酸[18]），通過形成穩(wěn)定的氫鍵來代替脂質(zhì)體膜上的水分子來保持其膜完整性。筆者首先嘗試了賴氨酸，通過電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不加凍干保護(hù)劑時，外泌體發(fā)生聚集和膜融合，這和Frank 等[19]發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞外囊泡直接冷凍干燥會導(dǎo)致其粒徑分布擴(kuò)大和聚集一致。而在加入50、100 和200 mmol/L 賴氨酸的凍干組中，外泌體呈現(xiàn)典型的杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，形貌較完整，但是不同濃度的賴氨酸均沒法徹底解決凍干時外泌體的聚集問題。另一方面，玻璃化模型是凍干保護(hù)劑（如糖類）與脂質(zhì)體形成高黏度水相，可以維持相鄰脂質(zhì)雙層之間的間距，降低脂質(zhì)雙層的表面張力，避免外泌體在冷凍干燥過程中出現(xiàn)膜融合和破壞[20-21]。因此，再根據(jù)玻璃化模型比較了乳糖、海藻糖和菊糖對外泌體的保護(hù)效果。其中菊糖因高玻璃化溫度在凍干外泌體的分散度上表現(xiàn)良好，但其分子量過大產(chǎn)生空間位阻，無法填補(bǔ)凍干時水分子的缺失造成外泌體膜破損。4%乳糖和2%海藻糖能很好地解決凍干時外泌體的聚集和保護(hù)外泌體形貌完整的問題，并且4%乳糖和2%海藻糖保護(hù)效果相當(dāng)。但由于許多人對乳糖不耐受，最終選擇了2%海藻糖作為凍干保護(hù)劑。EL Baradie 等[22]使用海藻糖和高分子化合物PVP40 結(jié)合凍干外泌體時，外泌體完整度和分散度都很好，但使用前需要將聚乙烯吡咯烷酮-40 去除，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，故直接使用2%海藻糖會更加方便快捷。為了驗(yàn)證2%海藻糖凍干是否會影響外泌體本身的功能，檢測凍干后血漿來源外泌體誘導(dǎo)血管生成功能是否保留[23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍干后的血漿來源的外泌體仍然可以誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞成管。接著將外泌體用2%海藻糖進(jìn)行凍干，在室溫儲存1 d、1 周和1 個月，評估在運(yùn)輸條件下儲存不同時間周期對凍干外泌體的影響。電鏡和納米粒經(jīng)分析結(jié)果顯示在室溫儲存1 d、1 周和1 個月后仍然保持著原有的形貌和分散度，不會改變外泌體的粒徑分布，并且防止了大量外泌體顆粒的損失。此外，還評估了外泌體表面蛋白保留情況和其作為載體的功能。免疫印跡結(jié)果顯示，2%海藻糖能防止外泌體表面的關(guān)鍵蛋白CD63 和CD81 的降解，這和前面報(bào)道的海藻糖能穩(wěn)定凍干的蛋白質(zhì)一致[24-25]。同時，添加2%海藻糖凍干后的外泌體常溫儲存后依舊能被細(xì)胞攝取，不會影響外泌體作為納米載體的進(jìn)入細(xì)胞的固有屬性。

綜上所述，本研究為外泌體的儲存提供了一個新的選擇，便于外泌體早日走向臨床應(yīng)用。但在目前的實(shí)驗(yàn)中，外泌體的儲存時間僅限于室溫下1 個月，外泌體的更長時間的儲存仍需進(jìn)一步研究和探索。