尿游離皮質醇萃取方法的改良及其檢測相關影響因素的分析

吳祝圓，黃毅文，賈子超，胡志東，羅微，2

（1.天津醫科大學總醫院檢驗科，天津 300052，2.天津醫科大學醫學技術學院，天津 300023）

皮質醇檢測是評估腎上腺功能的重要指標。血液中的皮質類固醇會與類固醇結合蛋白結合，僅有10%為游離狀態且能發揮生物學功能。尿皮質醇是血游離的皮質醇經腎小球過濾而來，其含量與血液中發揮生理功能的游離皮質醇濃度及其變化呈正相關。24 h 尿游離皮質醇（urinary free cortisol，UFC）測定相對不受晝夜節律變化影響，更能精準反映腎上腺皮質功能，也是診斷庫欣綜合征的可靠指標[1]。雖然UFC 檢測最先進檢測技術是液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[2]，但該方法因設備耗材成本高檢測通量低，尚未廣泛使用及驗證[3]。雖然新觀點認為二甲氯烷萃取-化學發光法檢測尿皮質醇受萃取、復溶等步驟干擾，應逐漸用LC-MS/MS 替代；但仍有很多實驗室還以二氯甲烷萃取-化學發光分析法為主，關鍵是它仍然保持成本低、通量高、重復性好等諸多優點[4]。

化學發光法（CLIA）檢測UFC 需要提前對尿標本進行萃取，這一過程暫未實現自動化，萃取過程難免受諸多影響因素干擾，對結果造成一定影響，目前臨床也尚無公認的理想萃取方法。本實驗室自該項目開展以來，一直采用較為傳統的二氯甲烷液相萃取-化學發光檢測法[5]。其萃取步驟大致為：（1）取24 h 尿0.5 mL 加二氯甲烷1 mL 于干凈的玻璃管中。（2）渦旋振蕩儀上振蕩5 min，離心5 min（3 000 r/min）。（3）取下層400 μL 于玻璃空管中水浴鍋內揮發蒸干。（4）加200 μL 生理鹽水復溶樣本后CLIA 檢測。

原方案中渦旋振蕩儀僅適合10 個以內檢測/次，常因受力不均容易使得混合物呈晶狀體致萃取過程本該出現的液面分層消失，導致一定概率的萃取失敗。為適應日益增長的標本量及標準化需求，本研究將對方案進行改良。同時本研究也將探討目前尚未見報道的尿標本留置時間、蛋白尿、潛血尿這三大因素是否對UFC 的萃取及檢測存在干擾，以期為臨床檢驗提供更多科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣本及分組 取2019 年12 月—2020 年12 月天津醫科大學總醫院檢驗科的23 例不同結果的24 h UFC 標本，其中8 例低值、8 例中值、7 例高值。低中高值的分組標準為：參照本實驗室的UFC 檢測參考范圍是30～110 μg/24 h（尿皮質醇濃度乘以24 h 尿量）。0～50 μg/24 h 納入低值組、50～110 μg/24 h 納入中值組，＞220 μg/24 h 納入高值組。取其中低、中、高各5 例用于改良萃取法與傳統方法檢測結果的比較。再取低、中、高各1 例用于精密度評估。另取低、中、高各1 例用于分析不同標本保存時間對結果的影響。1 例低值標本作為基質摻入皮質醇（Cor）質控品用于準確度驗證實驗。最后1 例中值標本作為基質用于尿蛋白及尿潛血干擾實驗。因實際臨床工作中同一標本的量無法滿足不同實驗的多次要求，因而不同實驗選擇了不同標本。

1.2 試劑與儀器 分析純二氯甲烷（天津市化學試劑三廠）、皮質醇測定試劑盒（化學發光）（英國西門子醫學診斷產品有限公司）、漩渦混合器XW-80A（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、HY-5A 回旋式振蕩器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）、全自動化學發光免疫分析儀IMMULITE 2000（德國西門子有限公司）、日立7180 全自動生化分析儀（日本HITACHI 公司）、全自動血細胞分析儀（希森美康XN-2000+PA-990）。液相色譜-串聯質譜儀AB SCIEX Triple QuadTM4500MD（美國SCIEX 公司）。

1.3 原理與方法 UFC 的檢測采用化學發光法，西門子公司IMMULITE 2000 全自動免疫化學發光自動分析儀的原理是患者尿標本中的皮質醇與發光劑吖啶酯標記的皮質醇競爭結合固相上的多克隆兔抗皮質醇抗體，它以共價形式連接至磁顆粒上，皮質醇含量與儀器測得相對光單位量之間成反比關系。其試劑詳情可見說明書。為保證檢測性能最佳，按照IMMULITE 2000 操作手冊進行日常維護、檢驗前的準備、設置、質控等。尿皮質醇的提取采用二氯甲烷萃取法，詳情如上文所述。改良之處為上文所述的步驟（2）替換成HY-5A 回旋式振蕩器并設定轉速為250 r/min，振蕩時間5 min。在改良的基礎上進一步探討標本留置時間、蛋白尿、潛血尿的UFC 萃取及檢測的干擾。在標本留置時間的實驗中，自初次檢測后，連續間隔24 h 再作檢測，標本儲存條件為4℃冷藏，不添加防腐劑。在尿蛋白及潛血干擾實驗中，選取1 份尿蛋白及反復凍融后的血常規上清標本與1 例已知UFC 值的樣本配制成不同濃度的尿蛋白樣本及尿潛血樣本，上機檢測Cor 值，計算實測值與理論值的偏差。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0 軟件進行分析，正態分布計量資料采用±s 表示，計數資料采用%表示，兩樣本均數間采用Student′s t 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者資料 本研究按隨機原則取低、中、高值的UFC 檢測標本23 例，其中男性10 例、年齡均數為（44.60±14.27）歲；女性13 例、年齡均數為（50.77±18.99）歲，具體信息、分組情況及24 h 尿量見表1。

表1 患者的臨床特征參數Tab 1 Clinical characteristics of patients

2.2 改良萃取法與原方法的萃取后分層效果比較 改良法（恒速回旋振蕩）的萃取分層與原方法（渦旋振蕩后）的分層效果對比如圖1 所示，A 管為改良法，B 管為原萃取法中常出現的混合物結晶不分層現象（其發生概率據本實驗室工作的統計不低于10%）。二氯甲烷所萃取的Cor（正常如圖1 中A管底部，非正常如B 管底部）若出現晶狀體將出現無法自然揮發現象，即使在65℃水浴鍋中也無法揮發。C 管為原萃取法成功案例的分層效果圖，但普遍可見仍有部分晶狀體現象?，F采用改良法后再未出現晶狀體帶過寬的現象，即提升萃取成功率至100%。

圖1 改良法與原方法的Cor 萃取分層效果對比圖Fig 1 Comparison of Cor extraction layering effect between improved method and original method

2.3 改良法與原方法的檢測結果比對及質量控制指標的分析 改良法與原方法的各組檢測結果并無統計學差異；其中低值組差異P=0.667，中值組差異P=0.693，高值組差異P=0.967，不同水平組P 均大于0.05，合計時P＞0.05。兩種檢測方法的具體結果見表2。兩種方法檢測的結果相關性分析見圖2所示，其相關性系數為R2=0.998 9。

表2 兩種萃取方法的結果比較（μg/24 h）Tab 2 Comparison of the results of the two extraction methods（μg/24 h）

圖2 兩種方法學檢測值的相關性分析Fig 2 Correlation analysis of detection values between two methods

2.4 改良法提升檢測精密度 從UFC 臨床標本中選取低（L=30 μg/24 h）、中（M=112 μg/24 h）與高（H=914 μg/24 h）3 個不同濃度的樣本，用兩種方法分別同時檢測20 次，計算批內變異系數（coefficient of variation，CV）；將3 個濃度的樣本連續檢測10 d，每天測定2 次，計算批間CV，詳情見表3 所示。結果顯示原方法的批間精密度在低、中值上CV 均大于了25%，而改良法批內和批間CV 均低于原方法。

表3 兩種萃取方法的精密度評估（μg/24 h，±s）Tab 3 Precision evaluation of two extraction methods（μg/24 h，±s）

表3 兩種萃取方法的精密度評估（μg/24 h，±s）Tab 3 Precision evaluation of two extraction methods（μg/24 h，±s）

注：L、M、H 分別代表低、中、高值組；CV：變異系數

濃度次數原方法批內批間LMHLMH CV（%）改良法CV（%）31.76±4.28 13.48 93.96±8.388.92 920.59±44.70 4.86 34.00±5.46 16.07 20 123.87±34.8828.16105.5±12.65 11.98 20 937.44±119.57 12.76 900.05±76.70 8.52 2027.99±5.30 2099±16.49 20 981.72±78.17 2033.05±8.48 18.95 16.65 7.96 25.65

2.5 改良法提升檢測準確度 準確度的評估采用Cor 質控品（伯樂免疫多項質控，批號40363）和尿基質（1 例臨床UFC 標本，用過量二氯甲烷萃取除去Cor）按比例自行配制成5 例覆蓋低中高值的樣品（值分別為12、75、107、165、210 μg/24 h），以Cor檢測行規所規定的1/4 總TEA 為差異判讀標準來判斷各檢測值是否符合，采用兩種萃取方法處理后同時檢測，以檢測值在1/4 總TEA 內即為合格，5 例樣本中80%合格則判讀為該方法準確度評估通過。檢測結果顯示，原方法中兩例與理論值中TEA 超過25%。未能通過準確度驗證，而改良法通過準確度評估。

表4 兩種方法的準確度驗證（μg/24 h）Tab 4 Accuracy verification of the two methods（μg/24 h）

2.6 改良法與LC-MS/MS 法的比對 本研究對15例標本同時送檢廣州金域檢驗公司，采用LCMS/MS 法檢測，儀器型號如上文所述，操作方法按相應說明書進行，根據反饋的實驗結果進行差異值及相關性分析。其結果詳情如表5 所示。兩種方法下各水平間無統計學差異（均P＞0.05）。

表5 改良法與LC-MS/MS 的結果差異（μg/24 h）Tab 5 Difference of the results between improved method and LC-MS/MS（μg/24 h）

將兩種方法學比較下的3 個不同檢測水平的值（來源于上表）合并后做了相關性分析，其結果如下圖所示。兩種方法間相關性好，相關系數R2值可達0.992 2。

2.7 標本留置時間對檢測結果的影響 取一組低、中、高值標本留樣1 周，間隔24 h 檢測，所有UFC標本重復檢測3 次，其結果的變化見圖4，統計分析發現不同組別、不同留置時間與原值相比差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結果發現并未出現值的下降，4℃封蓋冷藏條件下，尿Cor 檢測值穩定，受標本留置時間影響較小。

圖3 改良法與LC-MS/MS 檢測值的相關性分析Fig 3 Correlation analysis of improved method and LC-MS/MS

圖4 尿Cor 標本不同留置時間的檢測結果Fig 4 Detection results of urine Cor specimens with different indwelling times

2.8 尿蛋白對檢測結果的影響 取1 例UFC 已知值（100 μg/24 h）標本，同時檢測其尿蛋白=150 mg/24 h，以其作為尿基質添加胎牛血清（BSA）蛋白干粉，配制成不同濃度的蛋白尿（命名為P1～5）。按改良法萃取后上機檢測，觀察各自檢測值與期望值的差異，計算各濃度水平的回收率，結果顯示平均回收率為95.85%，初步揭示尿蛋白對Cor 檢測的影響較小，見表6。

表6 尿蛋白對尿Cor 干擾性分析Tab 6 Analysis of the interference of urine protein on Cor

2.9 尿潛血對檢測結果的影響 本研究取臨床血常規標本1 例（離心后去上清，得1 例Hb 檢測高值標本250 g/L），經反復凍融裂解紅細胞離心后取溶血標本上清與尿蛋白干擾實驗中的尿基質Hb 為0且已知UFC 的標本配制成不同梯度濃度Hb 值潛血尿標本（命名為H1～5），其檢測分析結果見表7。同理也僅計算平均回收率。在本干擾實驗中，其平均回收率為89.85%。尿Hb 濃度在2 000 μg/mL 時會出現下降10%左右（89.4%），尿Hb 達4 000 μg/mL 時會出現顯著性下降（65.1%）。

表7 血紅蛋白濃度對尿Cor 干擾性分析Tab 7 Analysis of the interference of urine Hb on Cor

3 討論

目前檢測UFC 最為經濟、便捷的方法仍是萃取24 h 尿的化學發光免疫分析法。我國多家知名醫院仍還采用此方法，所介紹的萃取步驟中均使用的是漩渦混合器，甚至部分實驗室所提及的漩渦混合器與本實驗室原方案中該儀器同型號（XW-80A）[6-8]。

本實驗室原方案中，渦旋混合會導致1/10 萃取失敗率如二氯甲烷萃取后液面不分層，出現晶體狀物質，更換不同的實驗員也不可避免。漩渦混合（XW-80A）沒有參數設置，效果取決于試管與軟墊的壓觸程度及時間，易導致乳化現象使萃取失敗。為提高效率，原方案常10 管/捆把進行渦旋震蕩，加劇了萃取失敗的概率，未見到相關文獻報道。本研究設想采用HY-5A 回旋式振蕩器替代漩渦混合器（XW-80A）。該回旋式振蕩器具有轉速可調、通量高優勢，但渦旋效果稍不如前者；二氯甲烷萃取UFC是否需要如此劇烈和時長的渦旋震蕩?改用此溫和振蕩方法是否影響檢測結果?改良法能改善UFC 萃取后的分層效果，但對檢測結果是否存在影響？筆者在低、中、高3 組合計15 例臨床標本中進行了兩種方法學的比對分析。結果證實，改用HY-5A 回旋式振蕩器（設定轉速250 r/min，5 min）滿足萃取需求提升了工作效率，兩方法的相關系數高達R2=0.998 9。檢測結果顯示差異并無統計學意義且相關性較好，為排除偶然性誤差影響，考慮到改良僅針對萃取步驟，可能改變實驗的穩定性及重復性，本研究進一步對質量控制中的評價指標進行了考察。結果提示，改良法批內和批間CV 均低于原方法，具有更高的精密度和準確度。準確度的評估方面存在一些困難，主要是暫無UFC 溯源化的標準品，但本研究采用Cor 質控品和尿基質自行配制的方法加以了解決。對改良法與LC-MS/MS 法的檢測結果進行了比較，結果發現兩者檢測結果差異無統計學意義且相關系數可達R2= 0.992 2，改良法不僅使得萃取失敗現象消失而且使日常檢測工作變得更高通量（可達80 個/次）。LC-MS/MS 是現階段最先進的方法，因LC-MS/MS 檢測的成本較高導致送檢的例數偏少，使得本研究存在一定局限性，但提示改良法幾乎等同于LC-MS/MS 的檢測效能?？傮w來說，改良法提高了萃取成功率、檢測通量并提升了方法學的精密度與準確度。

在臨床工作中會出現檢測值與臨床預判不符的現象，因而常需要對保留的標本進行復查，標本留置時間過久是否影響復查？尿皮質醇未見報道；庫欣綜合征患者約3/4 會出現高血壓，繼而可能引起腎臟損傷出現蛋白尿，蛋白尿是否會影響UFC 的萃取及檢測也尚未見報道；尿標本潛血對結果影響也未見文獻報道。本研究結果證實標本在4℃冷藏保留8 d 及高蛋白尿對檢測結果影響微乎其微；在尿蛋白干擾實驗中所配制的尿蛋白濃度≥3.5 g/24 h（大量尿蛋白定義，P5 干擾蛋白的濃度乘以尿量），在潛血干擾實驗中所配制的血紅蛋白尿的Hb 濃度大于了3 840 μg/mL（血皮質醇檢測干擾下限），最大限度地證明了這些干擾因素的不會產生影響。但潛血尿會使檢測值與理論值偏低，特別是當尿Hb達4 000 μg/mL 時會導致檢測誤差大于Cor 檢測所規定25%的TEA 值。總體來說，這些結果證實皮質醇的穩定性好，二氯甲烷萃取-化學發光免疫分析法受標本留置時間、高蛋白尿的因素影響基本可忽略不計。但血尿標本可能對萃取或檢測環節存在影響，不建議對尿路出血或其他原因所致的嚴重潛血尿做UFC 檢查。

綜上所述，本研究首次改良了現有的UFC 萃取方法并對標本留置時間、尿蛋白及潛血這3 個潛在的檢測干擾因素進行分析。方法學的改進提升了萃取效率及檢測結果的精密度與準確度，干擾因素的分析為臨床標本收集、復查及結果分析提供了重要的指導意義。