幼年特發性關節炎10p11.21 遺傳位點敲除的單克隆細胞系的建立

張四鵬，李津

（天津醫科大學基礎醫學院細胞生物學系，天津 300070）

自身免疫性疾病是指人體的免疫系統錯誤地攻擊自身的組織、器官，造成自身損傷。目前已經發現了超過80 種自身免疫疾病，總發病率為3%～5%[1]。其中兒童自身免疫疾病嚴重影響了兒童的身心健康，對個人及家庭帶來了重大的經濟負擔。兒童自身免疫疾病危險因素復雜多樣，多項研究顯示遺傳因素對疾病的發生發展有重要的影響[2]。因此，開展遺傳學研究對于兒童自身免疫疾病的預防和精準治療具有一定的指導作用。

近20 年來，全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）聚焦于基因組的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），無偏地系統性地研究了與復雜疾病和性狀相關的遺傳位點，取得了豐碩的成果，已有數千遺傳位點在文獻中報道[3]。但是關于這些位點的作用機制的研究卻很少[4]。

一項關于10 種兒童自身免疫疾病的研究報道了位于ANKRD30A 的內含子區域的SNPrs7100025與幼年特發性關節炎（Juvenile idiopathic arthritis，JIA）顯著相關[5]。但是對于這一位點如何影響疾病的發生、發展缺少相應的實驗研究。因此，本研究聚焦于對ANKRD30A 的內含子位點的功能研究，通過生物信息學分析和實驗方法精細定位這一位點的因果變異，利用CRISPR/Cas9 技術構建刪除因果變異所在基因組區域的單克隆細胞系，為后續機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用細胞人HEK293T 以及人Jurkat 細胞均購自ATCC 細胞庫，DMEM 培養基、1640培養基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰酶均購自美國Gibco 公司，使用的BsmbⅠ酶購自NEB 公司，KpnⅠ、HindⅢ酶和T4 連接酶購自Thermo 公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒購自promega 公司，PCR 酶和同源重組酶購自諾維贊公司。

1.2 方法

1.2.1 精細定位因果變異 PICS 平臺（https://pubs.broadinstitute.org/pubs/finemapping/）是一個對GWAS遺傳位點進行因果變異精細定位的在線分析網站[6]。該算法整合1 000 G 基因組數據中SNP 間的連鎖不平衡信息和各種免疫細胞中轉錄和順式調控元件，鑒定GWAS 遺傳位點最有可能導致疾病的因果變異，即PICS 概率（PICS_Probability）最高的SNP。使用此分析工具，輸入10p11.21 位點最相關的SNP（稱為index SNP）rs7100025 和疾病關聯強度P 值的負對數值-log10（P 值）=10.075 7。rs7100025與JIA 的關聯分析P 值=8.4E-11，所以其-log10（P值）=10.075 7。Ancestry 選擇EUR，可以得到這個位點的 SNPs 的 PICS 排序以及這些 SNPs 與rs7100025 之間的連鎖不平衡關系r2。

1.2.2 PheWAS 數據 PheWAS（Phenome-wide Association Studies，全表型關聯研究）是對一個特定的SNP 在全表型組中找到與它關聯的表型的一種研究方法，與GWAS 相反，被稱為反向GWAS。在Open Targets Genetics 數據庫中[7-8]，輸入rs7100025位點，得到與該位點相關的疾病信息。

1.2.3 細胞培養 HEK293T 細胞使用DMEM 完全培養基培養。DMEM 完全培養基由DMEM 空培加10%胎牛血清以及1%青霉素鏈霉素雙抗組成。Jurkat細胞使用1640 完全培養基培養。1640 完全培養基由1640 空培加10%胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素雙抗組成。兩種細胞均在37℃，5%CO2濃度的恒溫細胞培養箱中培養。

1.2.4 熒光素酶報告基因質粒構建 在rs7100025位點上下游各250 bp 設計引物。考慮到熒光素酶報告基因的方向效應，在其反方向上也同樣設計引物。引物序列見表1。以HEK293T 細胞的基因組DNA 為模板，用PCR 酶將其擴增。PCR 程序為：95℃3 min，95℃15 s 58℃15 s 72℃1 min 35 個循環，72℃5 min。使用的載體為PGL4.23，使用的酶切位點分別是HindⅢ和KpnⅠ。將PCR 產物和酶切產物同時跑膠純化，然后用同源重組酶將兩個產物進行無縫連接，用DH5α 感受態細胞進行轉化，鋪板。最后挑取單克隆進行搖菌擴增，選擇Sanger測序結果正確的質粒進行實驗。

構建rs7100025 次等位基因型（minor allele）即突變型的熒光素酶報告基因質粒，使用的引物序列見表1。以構建完成的野生型質粒為模板，PCR 程序為：95℃3 min，95℃15 s 58℃15 s 72℃7 min 30個循環，72℃5 min，PCR 產物用DpnⅠ酶37℃消化2 h，然后用DH5α 進行轉化、鋪板，挑取單克隆測序，選取測序結果正確的質粒進行實驗。構建的突變型質粒同樣經過Sanger 測序驗證。

表1 質粒構建引物序列Tab 1 Primer sequences for plasmid construction

1.2.5 熒光素酶報告基因實驗 將得到的rs7100025 位點的4 個質粒（野生型正向、野生型反向、突變型正向、突變型反向），各取500 ng 分別和50 ng PGL4.74 轉染6 孔板中生長的HEK293T 細胞，同時使用500 ng 空載的PGL4.23 與50 ng PGL4.74 作為對照組。轉染試劑使用的是PEI。轉染的時候使用無血清培養基，6 h 后更換為完全培養基，48 h 后收細胞，并使用promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒以及GloMax 20/20 儀器檢測熒光強度。

1.2.6 rs7100025 位點 gRNA 質粒構建 在rs7100025 位點上下游區域分別構建sgRNA，sgRNA1 序列: 5′-GCTTCTACAAGTCTTTTTCG-3′，sgRNA2 序列：5′ -AGTGGGATTGCCATGTTATT -3′ ，sgRNA3 序列：5′-CAGTAATTATCTATCGAGTG-3′，sgRNA4 序列：5′-GTTTTGCATCGTAGTTACAC-3′。將這些sgRNA oligo 退火形成雙鏈，退火的條件為95℃10 min，緩慢降溫至室溫2 h，同時以lenti-cas9-V2 質粒為載體，用BsmbⅠ55℃酶切2 h 回收。用T4連接酶將退火形成的sgRNA 雙鏈和回收后的載體片段連接，構建質粒，質粒均經Sanger 測序正確后使用。

1.2.7 rs7100025 位點敲除細胞系構建 將4 個構建好的rs7100025 位點sgRNA 質粒各2.5 μg，與PAX2 質粒6.5 μg，VSVG 質粒3.5 μg，在空培中混勻，并緩慢加入等體積的混有80 μg PEI 的空培，輕輕混勻后靜置20 min，加入到空培培養的10 cm 培養皿的HEK293T 細胞中，6 h 后將空培換成完全培養基。收取其培養48 h 后產生的病毒液，感染Jurkat細胞24 h，然后換取新鮮的完全培養基，加入終濃度2 μg/mL 的嘌呤霉素培養3 d，然后更換為新鮮的完全培養基。培養2 d 后，收集部分細胞，提取基因組DNA，PCR 進行基因型鑒定。PCR 條件：95℃3 min，95℃15 s 58℃15 s 72℃1 min 35 個循環，72℃5 min。

1.2.8 rs7100025 位點敲除細胞系的單克隆的篩選 對經鑒定產生rs7100025 位點敲除的細胞進行單克隆篩選。將細胞稀釋到100 個/mL 的濃度后，在顯微鏡下將單個細胞挑取到96 孔板中，每天觀察細胞的生長狀況，待細胞長滿96 孔板后將其傳至24 孔板內，待細胞量足夠后，收取部分細胞提取基因組DNA，然后做基因型鑒定。將PCR 產物進行瓊脂糖電泳實驗，選取有敲除的條帶進行Sanger 測序。將測序結果顯示rs7100025 位點有敲除的單克隆細胞進行傳代培養。

1.3 統計學處理 數據分析和作圖采用GraphPad Prism 7.0 軟件。兩組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學發現10p11.21 位點因果變異 表2 為PICS 值前5 的SNPs。rs7100025 的PICS 值為0.705 7，遠遠大于同一連鎖不平衡區域（Linkage disequilibrium，LD）的其他SNPs。

表2 10p11.21 位點的SNPs 為幼年特發性關節炎因果變異的PICS 后驗概率Tab 2 PICS posterior probability of being causal variants in juvenile idiopathic arthritis for SNPs at 10p11.21 locus

2.2 SNPrs7100025 是一個多效性變異 針對rs7100025 位點的PheWAS 研究顯示，rs7100025 與眾多疾病有著密切的關系，例如典型的心臟病、免疫系統疾病，rs7100025 是一個多效性變異（pleiotropic variant），對許多疾病有著重要影響，見圖1。

圖1 rs7100025 位點PheWAS 結果圖Fig 1 The results of PheWAS at rs7100025

2.3 PGL4.23-rs7100025 質粒構建 將rs7100025位點附近一段500 bp 的序列克隆到PGL4.23 載體上，如圖2 所示，rs7100025 位點正向和反向序列的PCR 產物為545 bp，載體用Hind Ⅲ和KpnⅠ雙酶切之后的長度為4 236 bp，通過同源重組技術將PCR 純化產物和載體純化產物連接。質粒構建成功后Sanger 測序無誤。

圖2 重組質粒PGL4.23-rs7100025 的構建Fig 2 Construction of recombinant plasmid PGL4.23-rs7100025

2.4 熒光素酶報告基因實驗檢測rs7100025 位點的功能 雙熒光素酶報告基因實驗顯示，正向插入包含G 等位基因和A 等位基因的rs7100025 序列可以提高熒光素酶報告質粒轉錄活性，并且G 等位基因效果更加明顯；反向插入包含C 等位基因和T等位基因的rs7100025 序列對基因的調控與空載對照相比無明顯差異，見圖3。

圖3 熒光素酶報告基因實驗檢測rs7100025 的轉錄調控功能Fig 3 Luciferase reporter gene assay detects the transcription regulatory activity of rs7100025

2.5 rs7100025 位點gRNA 質粒構建 Lenti-Cas9-V2 質粒經BsmbⅠ酶切之后的產物，瓊脂糖凝膠電泳回收12 988 bp 大小的條帶（圖4B），與退火形成的sgRNA 雙鏈用T4 連接酶連接，其中sgRNA 在基因組上的位置如圖4A 所示，構建好的質粒均經過Sanger 測序驗證正確。2.6 rs7100025 位點敲除的Jurkat 細胞系構建 利用構建的sgRNA 質粒以及慢病毒介導的感染技術，將rs7100025 位點在Jurkat 細胞系中進行敲除，并經過嘌呤霉素篩選，篩選出單克隆。單克隆細胞基因型鑒定的結果如圖所示（圖5A）。選取3 號單克隆做Sanger測序，測序結果如圖所示（圖5B）。Jurkat 細胞chr10:37303388 至chr10:37303844 的基因組DNA 序列（456 bp）被敲除。SNPrs7100025（chr10:37303610）就位于這段序列之中。因此，成功建立了幼年特發性關節炎10 號染色體上遺傳位點因果變異刪除的單克隆細胞。

圖4 rs7100025 位點敲除質粒的構建Fig 4 Construction of plasmids with rs7100025 genomic region being deleted

圖5 rs7100025 位點敲除的Jurkat 細胞系構建Fig 5 Construction of Jurkat cell line with rs7100025 region being deleted

3 討論

在過去十多年中，GWAS 已經對人類基因組中數百萬個遺傳變異進行了基因型-表型關聯測試，研究SNP 與疾病的相關性，報道了眾多復雜疾病的遺傳位點[4，9]。GWAS 中所發現的遺傳位點具有以下3 個特點。

（1）GWAS 研究發現的indexSNP 不一定是因果變異。由于LD 的存在，遺傳變異通常會與染色體上的一些臨近變異高度連鎖。因此，當一個區域中的一個或多個變異，對人類復雜特征或疾病產生因果效應時，該區域中的許多非因果變異也與疾病等表型呈現顯著相關性。目前已經有許多統計方法和基因組功能注釋被廣泛應用于確定因果變異[10-12]，例如貝葉斯分析、ANNOVAR 注釋軟件、VEP 注釋軟件等等。本研究使用了自身免疫病致病變異的遺傳和表觀遺傳精細定位平臺進行生物信息學分析確定了rs7100025 為10p11.21 位點最為可能的因果變異。

（2）無論是GWAS 的indexSNP 還是因果變異，大約93%的SNP 都位于基因組的非編碼區，例如基因的內含子和基因間的區域[13]。因此，GWASSNPs對疾病發生、發展的影響是通過其對靶基因的轉錄調控實現的。通過熒光酶素實驗證明了rs7100025具有調控轉錄的能力。

（3）GWAS 位點所調控的靶基因不一定是距離其最近的基因。有可能是eQTL 基因或者Hi-C 基因[14]，與GWAS 因果變異在基因組分布上有一定的距離。由于染色質的高度折疊，GWAS 因果變異與靶基因的啟動子區相反應，實現其對靶基因的遠端調控作用。

由于基因組編輯的困難，GWAS 位點的功能研究遠遠落后于GWAS 的遺傳學發現。CRSPR/Cas9 技術的發明和應用為進行GWASSNP 的功能研究提供了新的方向。在腎癌易感性遺傳位點的功能研究中，研究者在人腎細胞癌細胞中敲除因果變異rs35252396，獲得了單克隆細胞。進一步與野生型細胞相比，發現其所調控的靶基因及所影響的信號通路[15]。在另一項對多種自身免疫病的遺傳學研究中，作者利用CRISPR/Cas9 技術將rs558245864 位點敲除獲得了兩個雜合細胞系，并與野生型細胞系相比，發現這一位點對染色質可及性及基因轉錄的影響[16]。因此，建立因果變異刪除的單克隆細胞系是對GWAS 位點進行功能研究的重要環節。

GWAS 單一SNP 對疾病的作用力相對較小，體現為其OR 一般僅為1.1～1.2。此外，GWAS 位點的作用往往由多個變異共同驅動，對單個變異進行編輯可能無法表現出足夠的作用力以產生相應的細胞或生化水平的變化，因此對整個疾病遺傳位點的刪除可能是一種更為有效的研究策略[17-19]。同樣在技術上，對單一SNP 的編輯目前相對較難。因此在GWAS 位點的功能學研究中，往往對GWAS 位點進行敲除。敲除的片段大小從幾十個堿基到幾百個堿基不等。當然對單一SNP 編輯，更能精準地研究這一SNP 的功能和作用。在一項關于5 種血管系統疾病（vascular diseases）的研究中，研究者在內皮細胞和血管平滑肌細胞中特異性敲除了rs9349379 位點附近的88bp 區域，通過RNA-seq 實驗發現這一缺失導致內皮素-1（EDN1）基因的表達水平升高。然后再對rs9349379 位點進行單堿基的編輯，得到rs9349379的次等位基因型（G/G）的細胞系，驗證了EDN1 為rs9349379 位點的靶基因[20]。

利用CRSPR/Cas9 技術對免疫細胞進行基因組編輯的實驗存在著許多技術難點。與腫瘤細胞系的貼壁生長不同，作為自身免疫疾病的研究模型Jurkat 細胞是懸浮細胞。對其進行轉染效率低，因此采用了慢病毒感染的方法。通過獲得高滴度的病毒液來感染懸浮細胞，從而使懸浮細胞的基因組編輯成功進行。應用該技術成功敲除了Jurkat 細胞中rs7100025 所在的基因組區域，為尋找這一位點的靶基因以及后續的相關功能研究奠定了基礎。