大蒜素改善PM2.5致HUVEC氧化應激和凋亡

薛盼盼， 劉遠鳳， 姜小軍， 封少龍

(1.南華大學衡陽醫學院公共衛生學院，湖南省衡陽市 421001；2.桂林醫學院公共衛生學院預防醫學研究所，廣西壯族自治區桂林市 541199)

大量流行病學研究表明細顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)暴露與心血管疾病密切相關，即使是低水平的PM2.5暴露仍可影響心血管系統健康[1-4]。因此，發展藥物或食物來保護居民心血管健康具有重要意義。

大蒜素是大蒜的一種生物活性成分[5]，流行病學調查顯示，中國華北地區大氣PM2.5平均水平相對較高，但因PM2.5暴露引發的心血管疾病發病率和死亡率并未高于其他地區[6]，可能與該地區人們生活習慣(每天攝入較多的大蒜)有關。本研究探討大蒜素保護人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)免受PM2.5介導的氧化應激和凋亡的機制，為預防或減輕PM2.5對心血管健康的危害提供新的食物干預策略。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

PM2.5樣本由中國科學院廣州地球化學研究所提供，HUVEC來源于南華大學衡陽醫學院心血管疾病研究所。DMEM培養液購自Gibco公司(USA)；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；熒光分光光度計購自美國賽默飛公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；CCK8試劑盒和Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒購自日本Dojindo公司。活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司?？侴SH檢測試劑盒和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。FastPureCell/Tissue總RNA提取試劑盒、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。p53、磷酸化p53(p-p53)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白質(Bcl-2-associated X，Bax)、多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)、活化的PARP(cleaved poly-ADP-ribose polymerase，cleaved PARP)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)、活化的Caspase-9(cleaved Caspase-9)、Caspase-3、cleaved Caspase-3和細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體購自美國CST公司；核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環氧氯丙胺相關蛋白1(Keap-1)、HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG抗體購自美國Proteintech公司；磷酸化Nrf2(p-Nrf2)抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細胞分組及培養

細胞分為對照組、PM2.5組、大蒜素組、大蒜素聯合組。對照組不做任何處理，用配制好的新鮮DMEM培養液進行培養；PM2.5組培養液為PM2.5懸液加入新鮮DMEM培養液中，使PM2.5組培養液的終質量濃度為5 mg/L；大蒜素組培養液為大蒜素粉末加入新鮮DMEM培養液中，使大蒜素組培養液的終質量濃度為10 mg/L；大蒜素聯合組用5 mg/L PM2.5組培養液與10 mg/L大蒜素組培養液一起處理細胞。各組處理時間均為24 h。

1.3 CCK8試劑盒測定細胞活力

將HUVEC(104個細胞/孔)接種到96孔板中，待細胞生長至對數期后，按不同組別的因素處理細胞24 h。隨后，在96孔板的每個孔中加入10 μL CCK-8溶液孵育1～3 h后，酶標儀在450 nm處檢測細胞光密度值。根據光密度值制作生長曲線檢測細胞活力。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒測定凋亡率。各組按凋亡試劑盒說明書處理后，1 h內完成流式細胞儀檢測。

1.5 ROS、GSH、總GSH、MDA、MMP和抗氧化酶水平測定

將HUVEC接種到培養皿后，待細胞生長至對數生長期，進行不同組別處理，24 h后收集細胞。使用ROS、GSH、總GSH、MDA、MMP以及相關抗氧化酶檢測試劑盒測試細胞內抗氧化酶和代謝物的水平。

1.6 qRT-PCR測定mRNA表達水平

使用FastPureCell/Tissue總RNA提取試劑盒從細胞中提取總RNA，用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒測定靶基因(引物序列見表1)cDNA拷貝數。通過2-ΔΔCt方法計算靶基因相對mRNA表達水平。

表1 引物序列

1.7 Western blotting測定蛋白表達水平

蛋白裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白水平，調整蛋白水平，加入上樣緩沖液，煮沸10 min后聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉。將附有蛋白質的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)用TBST溶液洗滌3次，4 ℃一抗孵育過夜，然后二抗孵育1 h。最后使用增強型化學發光試劑盒在化學發光成像系統進行顯影。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 大蒜素對HUVEC活力的影響

與對照組比較，PM2.5組細胞活力降低；與PM2.5組比較，大蒜素聯合組細胞活力增加(P<0.05；圖1)。

圖1 大蒜素對HUVEC活力的影響a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與PM2.5組比較。

2.2 大蒜素對PM2.5誘導HUVEC凋亡的影響

與對照組比較，PM2.5組細胞凋亡率p-p53/p53、cleaved Caspase-9/Caspase-9、cleaved Caspase-3/Caspase-3和cleaved PARP/PARP升高，Bcl-2/Bax表達降低(P<0.05；圖2)。與PM2.5組比較，大蒜素聯合組凋亡率降低，p-p53/p53、cleaved Caspase-9/Caspase-9、cleaved-3/Caspase-3和cleaved PARP/PARP的表達降低，Bcl-2/Bax表達升高(P<0.05；圖2)。

圖2 大蒜素對PM2.5誘導HUVEC凋亡的影響A為各組流式細胞圖；B為各組細胞凋亡柱狀圖；C為各組蛋白條帶；D為各組相對蛋白表達柱狀圖。a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與PM2.5組比較。

2.3 大蒜素對HUVEC MMP的影響

與對照組比較，PM2.5組線粒體JC-1聚集體產生的紅色熒光減弱(圖3A)，Cyt C蛋白表達增高(P<0.05；圖3B、C)。與PM2.5組比較，大蒜素聯合組線粒體JC-1聚集體產生的紅色熒光增強(圖3A)，Cyt C蛋白表達降低(P<0.05；圖3B、C)。

圖3 大蒜素對HUVEC MMP的影響A為MMP的熒光圖(熒光染色，200×)；B為Cyt C的蛋白條帶；C為Cyt C蛋白表達水平柱狀圖。a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與PM2.5組比較。

2.4 大蒜素對HUVEC氧化應激的影響

與對照組比較，PM2.5組ROS和MDA水平增加，GSH/總GSH的比例和抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-PX)活性降低。與PM2.5組比較，大蒜素聯合組ROS、MDA水平降低，GSH/總GSH的比值和抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-PX)活性升高(表2)。

表2 大蒜素緩解PM2.5對細胞內ROS、GSH/總GSH、MDA、CAT、SOD、GSH-PX水平的影響

2.5 大蒜素對Keap-1/Nrf2信號通路蛋白表達水平的影響

與對照組比較，PM2.5組Keap-1蛋白表達增加，p-Nrf2/Nrf2蛋白表達降低(圖4)，抗氧化酶基因(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)的mRNA表達降低(P<0.05；表3)。與PM2.5組比較，大蒜素聯合組Keap-1蛋白表達降低，p-Nrf2/Nrf2蛋白表達升高，抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)mRNA表達增加(P<0.05；表3)。

圖4 Western blotting檢測細胞內的Keap-1、Nrf2蛋白表達

表3 Keap-1和p-Nrf2/Nrf2相對蛋白表達水平及抗氧化基因CAT、SOD、GSH-PX、GPX4的相對mRNA表達水平

3 討 論

心血管內皮細胞對維持心血管系統的正常生理功能具有至關重要的作用[7-10]。而PM2.5暴露誘導內皮細胞凋亡可能是促進動脈粥樣硬化及其并發癥的關鍵病理過程[11-13]。大蒜素具有抗癌、抗神經變性和改善脂質代謝作用[14-16]，但大蒜素保護PM2.5介導的內皮細胞凋亡的分子機制尚未研究清楚。

本研究結果表明，大蒜素能夠降低p53的磷酸化水平、下調cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白活化形式，增加HUVEC中的Bcl-2蛋白、Caspase-9、Caspase-3和PARP的酶原形式，表明大蒜素能夠通過阻斷細胞內凋亡途徑的信號轉導來保護心血管細胞免受PM2.5介導的凋亡作用。此外，大蒜素可以降低氧化應激，降低細胞內ROS和MDA水平，增加HUVEC中GSH/總GSH的比率，且能夠有效上調Nrf2蛋白表達并促進其磷酸化，增強下游抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)mRNA表達并增加其活性。同時，大蒜素能夠減輕HUVEC中PM2.5暴露導致的線粒體功能障礙和損傷，保持MMP并阻止細胞色素C釋放到細胞質中。

綜上所述，大蒜素可通過阻斷細胞內凋亡通路的信號轉導來保護HUVEC免受PM2.5介導的細胞凋亡，還可以通過多種抗氧化機制降低HUVEC中PM2.5介導的氧化應激，防止PM2.5暴露對人體心血管系統造成的損傷。