lncRNA C2dat2調控小鼠大腦中動脈栓塞再灌注損傷及神經元自噬和凋亡

賈文歆， 于振江， 王麗香， 周雪梅

(濟南市第八人民醫院神經內科，山東省濟南市 271104)

缺血性腦卒中又稱腦卒中，是心腦血管疾病中常見類型，具有高發病率、高死亡率、高致殘率和高復發率的特點，是全世界第二大死因[1]，目前缺乏有效治療方法，對存活者生存質量造成嚴重影響。中樞神經系統是大腦認知功能基礎，大腦缺血再灌注通常會伴有神經功能受損，且其損傷不可逆[2]，故此保護神經功能，促進神經功能恢復進而降低致殘率已成為目前缺血性腦卒中亟需解決的難題。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)不具有編碼蛋白功能[3]，但其在表達遺傳調控、轉錄水平及轉錄后調控等多方面發揮重要作用[4]。有研究證實，lncRNA C2dat2可以促進腦出血后神經元存活[5]。但lncRNAs在動脈栓塞再灌注過程中的調控作用尚不明確。本研究就lncRNA C2dat2對小鼠大腦中動脈栓塞再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury，MCAO/R)及神經元自噬、凋亡的影響進行了研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

二氧化碳培養箱購自合肥賽帆試驗設備有限公司；RNA提取試劑TRIzol及轉染試劑Lipofectamine 2000購自武漢極捷生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白測定試劑盒購自金克隆(北京)生物技術有限公司；ECL發光液、蘇木精-伊紅染色液購自北京伊塔生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司；LONZA ELx808酶標儀購自北京澤平科技有限責任公司；Bio-Rad伯樂PCR儀T100購自南京貝登醫療股份有限公司；磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，p-p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease protein，Caspase-3)、兔抗大鼠LC3多克隆抗體和兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗體、Beclin 1山羊多克隆抗體和GAPDH、β-actin購于Cell Signaling Technology公司。shRNA由上海漢恒生物技術有限公司設計并提供。

1.2 動物及分組

清潔級SD小鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質量(20.01±2.11)g，購于吉林四長制藥有限公司，許可證號SYXK(吉)2020-001。飼養于標準環境中，飼養條件是光照/黑暗時間各12 h，相對空氣濕度45%～55%，溫度22～26 ℃，可自由進食進水，適應性喂養1周。在整個實驗過程中對動物的處置均符合醫學倫理學標準。實驗分為假手術組、模型組、negative shRNA組和C2dat2 shRNA組，每組15只小鼠，后兩個shRNA組模型建立后在小鼠側腦室用0.5 ng/kg相應shRNA注射。

1.3 MCAO/R模型建立

參考文獻[6]，采用10 g/L戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉小鼠，沿頸部正中備皮消毒后切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉組織，露出頸總、頸外和頸內動脈；將尼龍魚線制成的線栓自頸內動脈穿入，經頸總動脈栓塞大腦中動脈；血管阻塞60 min后拔出線栓，恢復灌注。假手術組不阻斷頸總動脈，其余操作與其他組相同。

1.4 腦組織病理觀察

經腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用脫頸椎法處死小鼠，取出腦組織，固定于10%福爾馬林溶液中，采用常規方式進行脫水、包埋、切片處理。經蘇木精-伊紅(HE)染色后，置于顯微鏡下觀察。

1.5 神經功能缺陷評估

通過改良神經功能缺陷評分[7]評價小鼠神經功能改變情況，評分內容包括提尾實驗、行為功能、感覺實驗、平衡木實驗及反射實驗，總分20分，分值越高行為缺陷越嚴重。

1.6 TUNEL染色法檢測細胞凋亡

取出的腦組織脫水后浸蠟包埋，然后將蠟塊切成厚度5 μm的切片，脫蠟后進行TUNEL染色。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察切片中腦組織細胞的凋亡水平。

1.7 實時熒光聚合酶鏈反應檢測Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表達

實時熒光聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表達。采用TRIzol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA水平。按TaqMan? MicroRNA反轉錄試劑盒說明書以RNA為模板進行反轉錄獲得cDNA，置于4 ℃保存，進行熒光定量PCR擴增，設置反應條件：95 ℃5 min預變性；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，65 ℃延伸30 s，擴增35個循環。以β-action為內參，Caspase-3上游：5′-GAGCTTGGAA CGCGAAGAAA-3′，下游：5′-TCAATACCGCGCAGTCCAGCTC-3′；MAPK上游：5′-GAGCTGCGTCGAAC CGT-3′，下游5′-CCTCCCAGACGGTCTTGTTC-3′；β-action上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-ACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCT法計算Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA相對表達量。

1.8 Western blotting檢測自噬蛋白

取梗死周圍區域腦組織，放入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1自噬蛋白水平。沸水浴中10 min，電泳后轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，然后加入相應二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，發光液進行顯色，以GAPDH為內參。在ECL試劑盒進行顯影。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 lncRNA C2dat2對大腦組織病理學改變的影響

假手術組小鼠大腦組織結構清晰，神經元細胞胞體大小正常，呈多角形，染色均勻，核仁明顯。模型組大腦皮層區出現明顯缺血灶，腦組織明顯水腫，神經細胞排列無規則，并可見大量細胞變性壞死。negative shRNA組與模型組病理改變類似。C2dat2 shRNA組與假手術組組織形態接近，有少量神經細胞壞死(圖1)。

圖1 lncRNA C2dat2對MCAO/R小鼠大腦組織病理學改變的影響(HE染色，200×)

2.2 lncRNA C2dat2對神經功能的影響

與假手術組比較，小鼠神經功能缺陷評分其他組均明顯升高，且同組比較，評分隨時間依次下降，C2dat2 shRNA組評分低于同時間negative shRNA組(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA C2dat2對MCAO/R小鼠神經功能缺陷評分的影響(n=15) 單位：分

2.3 lncRNA C2dat2對大腦細胞凋亡的影響

模型組和negative shRNA組細胞凋亡率高于假手術組，C2dat2 shRNA組細胞凋亡率低于negative shRNA組(P<0.05；圖2)。

圖2 lncRNA C2dat2對MCAO/R小鼠大腦細胞凋亡的影響(TUNEL染色，200×)1為假手術組；2為模型組；3為negative shRNA組；4為C2dat2 shRNA組。a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.4 lncRNA C2dat2對腦組織自噬蛋白水平的影響

模型組和negative shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平高于假手術組，C2dat2 shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平低于negative shRNA組(P<0.05；圖3)。

圖3 lncRNA C2dat2對MCAO/R小鼠腦組織自噬蛋白水平的影響1為假手術組；2為模型組；3為negative shRNA組；4為C2dat2 shRNA組。a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與negative shRNA組比較。

2.5 lncRNA C2dat2對Caspase-3和p-p38 MAPK mRNA水平的影響

模型組和negative shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達水平高于假手術組，C2dat2 shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達水平低于negative shRNA組(P<0.05；表2)。

表2 lncRNA C2dat2對MCAO/R小鼠腦組織Caspase-3和p-p38MAPK mRNA水平的影響(n=15)

3 討 論

本研究構建小鼠大腦中動脈栓塞再灌注損傷模型，經腦側注射negative shRNA或C2dat2 shRNA，觀察小鼠腦組織病理變化，發現模型組小鼠大腦皮層區出現明顯的大腦動脈栓塞再灌注的特征；而C2dat2 shRNA組小鼠大腦組織形態與正常小鼠大腦組織形態基本接近，可見少量神經壞死細胞。研究結果表明，降低C2dat2表達可能可以減輕小鼠大腦損傷。lncRNAs是一類不具有編碼蛋白質能力的RNA，屬于線性RNA[8-9]。lncRNAs參與調節細胞分化、發育、防御以及免疫應答系統等多種重要的生物行為過程[10]。lncRNAs在人類腫瘤中的作用研究最為深入，而在心腦血管疾病中的研究起步較晚。既往研究顯示，lncRNA-CARL通過抑制機體線粒體分裂和心肌細胞凋亡，從而降低腦缺血再灌注對神經的損傷[11]。為進一步分析C2dat2在MCAO/R模型小鼠中發揮的作用，本文進行小鼠神經功能學評分發現，C2dat2 shRNA組神經功能缺陷評分明顯低于模型組和negative shRNA組，說明降低C2dat2表達可減輕MCAO/R對大腦神經功能的損傷。既往研究顯示，腦梗死早期血清lncRNA XIST與急性腦梗死早期神經功能缺損有關，可作為腦梗死潛在分子靶點[12]。本研究結果還發現，C2dat2 shRNA組細胞凋亡率顯著少于模型組，而模型組多于正常小鼠，提示MCAO/R可造成腦細胞大量死亡，減低C2dat2表達可有效抑制腦細胞壞死。C2dat2 shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表達水平明顯低于模型組；而模型組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表達水平高于假手術組。自噬是通過吞噬自身細胞內大分子物質和細胞器，體現細胞本身代謝需要和細胞器更新的過程[13]。在受損的細胞器激活細胞壞死或凋亡之前，適時清除受損的細胞器是一種重要的保護機制，以完成細胞自身的代謝需要和細胞器的更新，對于穩定細胞正常的生長和代謝具有重要作用。人們發現自噬與神經元損傷有關，發揮了神經保護作用，而自噬又與細胞凋亡密切相關。近年來，自噬被認為是除細胞壞死和凋亡之外的一種細胞死亡方式，但在大腦的缺血再灌注損傷中，適度自噬可以激發身體自我修復能力，有利于大腦的神經損傷的修復，而當自噬被過度激活后，則進一步促進受損腦神經細胞死亡，加重病情發展[14-15]。本研究發現，降低C2dat2表達可抑制機體自噬過度激活，減輕細胞壞死，起到保護大腦細胞的作用。

此外，C2dat2 shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達水平明顯低于模型組；模型組Caspase-3和p-p38MAPK表達水平明顯高于假手術組。Caspase-3又稱為死亡蛋白酶，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是凋亡的細胞內途徑和細胞外途徑共同的下游效應分子，也是細胞凋亡的必經之路[16]。p38 MAPK信號通路可以在細胞外刺激下激活，激活的p38在炎癥、細胞凋亡中發揮重要作用[17]。當腦梗死發生后，缺血區內的神經細胞及星形膠質細胞中p38 MAPK的活性被激活，參與調節細胞凋亡過程[18]。本研究結果說明，降低C2dat2的表達可抑制小鼠大腦細胞凋亡和自噬，其可能是通過抑制Caspase-3和p-p38MAPK表達實現的。

綜上所述，MCAO/R損傷程度與C2dat2的表達高低有關，降低C2dat2表達可減輕MCAO/R損傷，抑制大腦細胞凋亡和自噬，其可能與MAPK信號通路有關。本研究結果尚存在一定的局限性，神經細胞損傷修復的機制很復雜，往往是多方面因素共同作用的結果，需要大量實驗數據進行驗證。