乙酰甲喹注射液含量測定方法的建立及方法對比

高 婷，李應超，劉 鈞，杜繼紅，張小飛，周艷飛，周保騰，鞏 浩，秦俊杰，王亞芳★

（1.北京市獸藥飼料監測中心 102629；2.北京生泰爾科技股份有限公司 102629）

乙酰甲喹屬于喹噁啉類合成抗菌藥，具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌作用強于陽性菌，對仔豬黃痢、白痢、犢牛副傷寒、雞大腸桿菌均有效，主要用于密螺旋體所致豬痢疾及細菌性腸炎[1-3]。近年來研究發現喹噁林類藥物在動物體內代謝后會產生毒性較大的代謝物，會對組織造成一定的毒性損害，進而有致畸、致癌、致突變的風險，因此建立一種穩定的乙酰甲喹注射液含量測定方法具有重要的意義[4-6]。

目前乙酰甲喹注射液含量測定標準為：精密量取本品適量（約相當于乙酰甲喹0.2 g）置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取四次（40、30、30、30mL），合并三氯甲烷，低溫蒸干，殘渣加醋酐20mL，振搖使溶解，加結晶紫指示液1滴，用高氯酸（0.1 mol/L）滴定至溶液顯黃綠色，并將滴定結果用空白試驗校正[7]。上述方法為非水滴定法，處理步驟繁瑣，對人員操作水平及經驗要求較高，提取過程中容易增大誤差，方法專屬性不強[8-10]。為統一相同組分獸藥檢驗質量標準，使檢驗流程更加標準化、科學化，參照乙酰甲喹原料藥及乙酰甲喹片含量測定項質量標準，修訂乙酰甲喹注射液含量測定項。本實驗采用紫外-可見分光光度法測定乙酰甲喹注射液的含量，并對該方法精密度、穩定性、重復性和加樣回收等結果進行考察，考察結果符合要求。方法簡便、快速、環境友好，可為獸藥產品質量檢測部門提供科學的技術方法與依據。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

紫外分光光度計，型號SHIMADZU UV-2450

1.2 實驗試劑及樣品

1.2.1 實驗試劑：①乙酰甲喹對照品，來源/批號/規格：中國獸醫藥品監察所/K0111704/100.0%；②甲醇，來源/批號/規格：Fisher Chemical/203196/99.9%；③鹽酸，來源/批號/規格：國藥集團化學試劑有限公司/10011018/36.0%～38.0%；④二甲基甲酰胺，來源/批號/規格：北京化工廠/20130814/99.5。

1.2.2 實驗樣品： 《獸藥質量標準》（2017年版）中乙酰甲喹注射液共有3個含量規格：0.5%，2%和5%。本實驗樣品來源為企業提供及抽檢樣品，共計9批，其中0.5%規格有2批，為以下編號①和②，2%規格有3批，為以下編號③、④和⑤，5%規格有4批，為以下編號⑥、⑦、⑧和⑨。9批樣品覆蓋標準中3個含量規格。

2 方法

2.1 紫外-可見分光光度法條件

檢測波長：400～200 nm；狹縫寬度：2.0 nm；采樣間隔：0.5 s。

2.2 溶液配制

2.2.1 乙酰甲喹對照品溶液配制 取乙酰甲喹對照品50 mg，精密稱定，置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續濾液5mL，置100mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 乙酰甲喹注射液溶液配制 精密量取本品適量（約相當于乙酰甲喹50 mg），置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續濾液5mL，置100mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 精密度考察溶液配制同2.2.1.

2.2.4 穩定性及重復性考察溶液配制同2.2.2

2.2.3 加標回收樣品溶液制備 精密量取規格為0.5%的樣品①5mL，分別精密加入乙酰甲喹對照品20 mg、25mg、30mg；精密量取規格為2%的樣品④1mL，分別精密加入乙酰甲喹對照品16mg、20mg、24mg，稀釋步驟同2.2.2。

3 結果與分析

3.1 確定是否有非法添加

根據農業農村部169號公告對9批樣品進行非法添加篩查，結論為9批樣品未添加水楊酸。

3.2 確定最大吸收波長

取2.2.1溶液，按照條件2.1，進行200～500nm全波段掃描，根據吸收光度值及波峰位置，確定乙酰甲喹的最大吸收波長為381 nm，圖1為乙酰甲喹對照品溶液的紫外吸收圖譜。

圖1 乙酰甲喹對照品溶液的紫外吸收圖譜

3.3 精密度

取樣品①，按照條件2.1，照紫外-可見分光光度法測定，連續測定6次，吸光度分別為0.540、0.544、0.545、0.546、0.548、0.547，計算吸光度RSD值，經計算，RSD值為0.16%。

3.4 穩定性

取樣品①，分別于0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h照紫外-可見分光光度法測定，吸光度分別為：0.566、0.566、0.565、0.565、0.567、0.567，計算含量RSD值，經計算，RSD值為0.16%。

3.5 重復性

取樣品①共6份，照紫外分光光度法測定，吸光度分別為0.565、0.567、0.564、0.566、0.566、0.564，計算含量的RSD值，經計算，RSD值為0.20%。

3.6 線性關系

取乙酰甲喹對照品50 mg，精密稱定，置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、10mL續濾液，置100mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，照紫外-可見分光光度法測定，以乙酰甲喹對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，如圖2，線性范圍為2～20μg/mL，線性相關系數為0.9999。

圖2 乙酰甲喹注射液線性相關曲線

3.7 加標回收試驗

取樣品① 5mL、樣品④ 1mL、樣品⑦ 0.5mL，分別按照樣品含量的80%、100%、120%進行加標回收，加標回收率在97.91%～102.99%范圍內，RSD小于2.0%，具體結果如表1：

表1 樣品加標回收試驗結果

3.8 對9批樣品分別采用非水滴定法和紫外-可見分光光度法計算含量，具體結果對比如表2：

表2 兩種方法測定9批樣品結果及對比

4 討論與結論

新建立的紫外-可見分光光度法的精密度、穩定性和重復性的RSD值分別為0.165，0.16%，0.2%，線性范圍為2～20μg/mL，線性相關系數為0.9999，加標回收率為97.91%～102.99%。經方法對比發現，紫外-可見分光光度法測量結果相對偏差為0%～0.1%，低于該方法相對偏差規定值1.0%，非水滴定測定結果相對偏差為0.1%～1.1%，高于該方法相對偏差規定值0.5%，由此可見，紫外-可見分光光度法穩定性高于非水滴定測定法；另外兩種方法平均偏差為0.5%～2.0%，偏差較大，而且非水滴定法含量測定結果偏低，可能是由于萃取過程及蒸干過程中造成乙酰甲喹物質流失。與原標準中非水滴定法相比，該方法簡便、快速、穩定，具有環境友好性。