響應面法優化大孔樹脂純化毛木耳多糖工藝

羅淼，黃榮

成都師范學院 化學與生命科學學院，功能分子結構優化與應用四川省高校重點實驗室（成都 611130）

毛木耳（Auricularia polyricha）又稱黃背木耳，屬于擔子菌綱，木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia）的毛木耳種（A.polytricha）[1]，是食藥兩用性食用菌，具有益氣強身、活血、止血、止痛、防癌抗癌之功效[2]。毛木耳多糖屬于酸性雜多糖，由五種單糖和葡萄糖醛酸組成[3]。毛木耳多糖具有提高機體免疫力、抗癌抑癌、抗凝血、降血脂、抗衰老及改善心臟功能等作用[4-5]。目前對黑木耳多糖的研究居多，毛木耳多糖較黑木耳多糖含有較多的膠質，提取難度較黑木耳更高，但毛木耳產地分布廣泛，產量豐富，價格比黑木耳便宜，其子實體中多糖含量明顯高于黑木耳中的含量，具有深入研究的價值。目前國內外對毛木耳的研究主要集中在栽培技術方面，而對毛木耳多糖純化工藝還未見報道[6]。大孔樹脂由于其獨特的多孔結構及材料性質，多應用于黃酮[7]、多糖等[8-9]的分離純化。研究首先采用復合酶-超聲波提取毛木耳粗多糖，并進一步選用D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A這7種大孔吸附樹脂對毛木耳提取物進行純化研究，篩選出最佳的純化樹脂及最優的分離，為更有效地開發和利用毛木耳資源提供試驗依據。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與材料、試劑

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析）；PHS-3CW數字酸度計（上海殷特）；FA2204N分析天平（上海菁華公司）；202-1A電熱恒溫干燥箱（北京中興公司）；KS康氏震蕩器（江蘇榮華儀器制造有限公司）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

毛木耳粉（于5—6月份采自四川什邡市澗氐鎮木耳種植基地，于60 ℃烘干，粉碎過0.250 mm篩）；葡萄糖標準品（成都康邦生物科技有限公司）；D-101型大孔樹脂（天津大學農藥廠）；D-141、X-5大孔樹脂（上海試劑一廠）；AB-8、HPD-100、MCA-9、HPD-100A型大孔樹脂（南開大學化工廠）；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸均為國產分析純。

1.2 復合酶-超聲波法提取毛木耳多糖

稱取一定量毛木耳粉，按適當料液比提前浸泡24 h，加復合酶[添加量為毛木耳粉質量3%（纖維素酶∶果膠酶=1∶1）]于溶液中，調節pH 4，60 ℃水浴下酶解60 min，煮沸滅酶10 min。在超聲功率200 W、溫度45 ℃下提取20 min，離心，在上清液中加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），劇烈振蕩30 min，離心，取上層清液濃縮、醇沉、干燥，得毛木耳粗多糖[10-11]。

1.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[12]測定毛木耳多糖含量。繪制葡萄糖標準曲線Y=0.017 8X-0.017 5，R2=0.995 8，線性范圍在0～32 mg/mL的范圍內，質量濃度與吸光度有良好的線性關系。

式中：C為試液中的葡萄糖質量濃度，mg/mL；D為多糖的稀釋因素；F為換算因子；W為毛木耳質量，g。

1.4 大孔樹脂的篩選

將預處理的D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A型大孔樹脂（濕樹脂）[7]，各取5 g置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL樣液，于25 ℃恒溫振蕩3 h，靜置24 h，過濾，測定濾液的多糖質量濃度，計算各種樹脂的吸附率E（%）[7]。將靜態吸附后的樹脂用適量純化水進行洗脫后，加入80%乙醇，振蕩3 h，靜置24 h，充分解吸后過濾，測定濾液的多糖質量濃度，計算各樹脂解吸率B（%）[7]。

式中：C0為吸附前多糖的質量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余液多糖的質量濃度，mg/mL；C2為解吸液中多糖的質量濃度，mg/mL；V0為樣品體積，mL；V1為吸附后剩余溶液體積，mL；V2為解吸體積，mL。

1.5 D-101靜態吸附的動力學曲線

取5 g預處理好的D-101型大孔樹脂，放入50 mL錐形瓶中，加入25 mL質量濃度為4.0 mg/mL的毛木耳粗多糖溶液，將錐形瓶于搖床振蕩4 h，每0.5 h取2 mL溶液，用1.3小節的方法測定多糖含量，計算吸附率，繪制吸附曲線。

1.6 D-101大孔樹脂純化工藝單因素試驗

1.6.1 上樣液質量濃度對吸附率的影響

取7份預處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，加入質量濃度為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mg/mL的粗多糖溶液，調節pH 4，以2.0 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節的方法測定多糖含量，計算大孔樹脂吸附率。

1.6.2 上樣液pH對吸附率的影響

取6份預處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按1.6.1小節確定最佳質量濃度條件，用稀鹽酸調節質量濃度為4.0 mg/mL的粗多糖溶液pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，以2.0 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節的方法測定多糖含量，計算大孔樹脂吸附率。

1.6.3 上樣液速度對吸附率的影響

取6份預處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按以上確定的最佳條件，取質量濃度4.0 mg/mL，pH 4的粗多糖溶液，分別以1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節的方法測定多糖含量，計算大孔樹脂吸附率。

1.6.4 洗脫劑質量分數對解吸率的影響

取7份預處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進行上柱，以相同速率用適量純化水進行洗脫后，各層析柱分別用10%，30%，50%，70%，80%，90%和95%乙醇進行洗脫，洗脫速度2.0 mg/min，收集洗脫液，按1.3小節的方法測定含量，計算大孔樹脂解吸率。

1.6.5 洗脫速率對解吸率的影響

取5份預處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進行上柱，以相同速率用適量純化水進行洗脫后，各層析柱用80%的乙醇進行洗脫，洗脫速率為0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/min，收集洗脫液，按1.3小節的方法測定多糖含量，計算大孔樹脂解吸率。

1.6.6 洗脫劑用量對解吸率的影響

取5份預處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進行上柱，以相同速率用適量純化水進行洗脫后，各層析柱用2，3，4，5和6 BV的80%的乙醇進行洗脫，洗脫速率為2.0 mL/min，收集洗脫液，按1.3小節的方法測定多糖含量，計算大孔樹脂解吸率。

1.7 響應面試驗因素和水平

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的試驗設計原理，以上樣液pH（A）、上樣液質量濃度（B）和上樣液速度（C）為響應值，設計響應面試驗。試驗因素與水平值見表1。

表1 響應曲面分析試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的選取

從表2可以看出，D-101型樹脂在吸附率以及解吸率上都較高，表現出良好的吸附和解吸性能。因此，最終選擇D-101型大孔樹脂作為接下來試驗的樹脂。

表2 七種大孔樹脂的靜態吸附與解吸結果

2.2 D-101靜態吸附的動力學曲線

如圖1所示，D-101型大孔樹脂對多糖的吸附在前2 h呈上升趨勢，在2 h后吸附率呈穩定趨勢，逐漸平穩。

圖1 靜態吸附的動力學曲線

2.3 吸附工藝研究

2.3.1 單因素試驗結果

2.3.1.1 上樣液質量濃度對吸附率的影響

如圖2所示，當上樣液質量濃度小于4 mg/mL時，大孔樹脂對多糖的吸附率呈增長趨勢，當質量濃度過大時，明顯可以看出吸附率不再上升，反而下降。因此，選取4 mg/mL為上樣液最佳質量濃度。

圖2 上樣液質量濃度對吸附率的影響

2.3.1.2 上樣液pH對吸附率的影響

pH對多糖的存在影響很大，因而也會影響到吸附率。如圖3可知，選取pH 4上樣，吸附率達到最佳。

圖3 上樣液pH對吸附率的影響

2.3.1.3 上樣液速度對吸附率的影響

由圖4可知，總體來看，上樣液速度在吸附過程中的影響不是很大，因此，選擇2.5 mL/min作為上樣液速度，既可保證吸附的程度又節約了時間。

圖4 上樣液速度對吸附率的影響

2.3.2 響應曲面試驗

綜合單因素試驗影響結果，以對毛木耳多糖吸附率影響顯著的三個因素（上樣液pH、上樣液質量濃度、上樣液速度）為自變量，采用Design Expert軟件對試驗數據進行三因素三水平響應面試驗。響應面分析方案與結果見表3。

表3 響應面分析試驗方案及試驗結果

運用Design Expert軟件分析，以上樣液pH、上樣液質量濃度、上樣液速度為響應變量，多糖吸附率為響應值，進行回歸擬合分析，可得到模型：Y=78.70+ 0.90A+1.70B+1.14C-0.48AB+0.18AC-0.51BC-2.26A2-1.11B2-1.58C2。

其中，對回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表4。方程中的B、A2影響極其顯著，C、C2的影響顯著。該模型的R=0.954 4，R值越接近于1，擬合度越高，自變量和響應值之間線性關系越顯著。表4中，FA=5.52，FB=19.52，FC=8.90，所以各因素對吸附率的影響程度大小為上樣液質量濃度＞上樣液速度＞上樣液pH。

表4 吸附率回歸方程的方差分析結果

響應面優化D-101大孔樹脂對毛木耳多糖吸附率的最佳方案為上樣液質量濃度4.68 mg/mL，上樣液pH 4.14，上樣液速度2.63 mL/min，此條件下理論吸附率為79.48%。

采用交互作用組圖即可對兩兩因素交互影響毛木耳多糖吸附率的效應進行分析和評價，如圖5所示。各個響應曲面的開口均為向下的凸面，表示該模型在試驗范圍內存在穩定點，且穩定點為最大值。各個等高線呈圓形，兩因素的交互作用不明顯。綜合分析可得上樣液質量濃度對吸附率的數值影響最大。

圖5 兩因素交互作用對吸附率影響的響應面及等高線圖

2.4 洗脫工藝研究

2.4.1 洗脫劑體積分數對解吸率的影響

不同體積分數乙醇對解吸率有所影響，當乙醇體積分數增加時，解吸率升高，由圖6可知，95%的乙醇和80%的乙醇洗脫能力相差不大，綜合考慮，選擇80%的乙醇為最佳洗脫體積分數，既節約成本，同時也具有良好的洗脫效果。

圖6 洗脫劑體積分數對解吸率的影響

2.4.2 洗脫速率對解吸率的影響

由圖7可知，當洗脫速率增大時，解吸率會減小，但洗脫速率過小，需花費時間過久，綜合考慮，選擇2.0 mL/min為最佳洗脫速率。

圖7 洗脫速率對解吸率的影響

2.4.3 洗脫劑用量對解吸率的影響

由圖8可知，當洗脫液用量超過4 BV時，解吸率不會出現大幅度增加趨勢，故選擇4 BV 80%乙醇溶液為最佳洗脫劑用量。

圖8 洗脫劑用量對解吸率的影響

2.5 最佳條件的純化結果

取3份預處理好的D-101型的大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，毛木耳多糖溶液5 mg/mL，pH 4，以2.5 mL/min的速率上柱，以相同速率用適量純化水洗脫，再用4 BV的80%乙醇溶液以2.0 mL/min的速率洗脫，收集洗脫液，按1.3小節的方法測定。純化前多糖含量為8.31%，純化后為23.59%，表明純化效果較好。

3 結論

研究探討大孔樹脂純化毛木耳多糖的最佳工藝條件，通過比較7種大孔樹脂的靜態吸附-洗脫效果，并結合樹脂的靜態吸附動力學，確定采用型D-101大孔樹脂純化提取粗多糖。結合單因素試驗和響應曲面試驗，以多糖吸附率為檢測指標，優化出D-101型大孔樹脂吸附多糖最佳工藝條件：上樣液質量濃度4.68 mg/mL，上樣液pH 4.14，上樣液速度2.63 mL/min，理論吸附率為79.48%。再通過對洗脫工藝進行單因素試驗，得出D-101型大孔樹脂解吸條件：4 BV 80%乙醇溶液，2.0 mL/min的洗脫速率進行解吸，其解吸率為81.75%。在最佳純化工藝條件下多糖含量由8.31%增加到 23.59%，毛木耳多糖的純化率較好，結果穩定可靠。