辣木籽總黃酮提取工藝

侯真真，謝曉帆，李瑞婷

廣州工商學(xué)院（廣州 510850）

辣木為多年生熱帶落葉喬木，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國云南、廣西等地區(qū)已有種植，因其根具有辛辣味而得名。辣木籽是辣木的種子，是徑約8 mm的橢圓性球狀物體，去殼呈白色，可直接食用，富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、黃酮及多酚等化合物，具有降血壓、抗氧化、抗癌等多種生物活性功能，是一種新資源食品，具有一定的研究價(jià)值。由于辣木獨(dú)特的抗菌及絮凝屬性，辣木籽也被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)凈化處理。此外，辣木籽是化妝美容產(chǎn)品、新能源柴油的潛在優(yōu)質(zhì)原料之一[1]。

黃酮類化合物，又稱黃酮體、黃堿素，對(duì)防治肝病，防癌抗癌，抑制肥胖，預(yù)防基因突變，治療冠心病、心絞痛、高血壓，活血化癖也起重要藥理活性作用[2]。辣木籽中的黃酮類化合物豐富，主要以結(jié)合形式存在，具有抗腫瘤、降血糖、護(hù)肝殺蟲、減肥降脂、活血化瘀等作用[3]。近年來，辣木籽被指定為國家新資源食品開發(fā)的原材料，具有較大開發(fā)潛力和前景。因此，研究辣木籽中黃酮類化合物的提取工藝具有重要的意義。研究采用超聲波輔助提取辣木籽中黃酮類化合物，并進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為辣木籽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，市售；無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（西安匯林生物科技有限公司）；六水合三氯化鋁（分析純，西隴科學(xué)化工）。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S電子天平（右一儀器有限公司）；UV-2450數(shù)顯紫外分光光度計(jì)（連華科技有限公司）；DL-5-B臺(tái)式高速離心機(jī)（安亭科學(xué)儀器廠）；BDA-1002超聲震蕩器（微米派科技有限公司）。

1.3 工藝流程

原生態(tài)辣木籽→去殼→干燥（60 ℃熱風(fēng)烘干）→粉碎過篩（0.250 mm篩）→稱取2 g干粉→加入一定量乙醇→超聲波輔助提取→水浴→離心機(jī)過濾→取上清液→加入三氯化鋁顯色→定容→測(cè)定總黃酮含量

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的制備

辣木籽總黃酮粗品制備：在60 ℃鼓風(fēng)箱烘干一定時(shí)間至恒重，粉碎過0.180 mm分子篩，制得辣木籽粉末，將粉末置于干燥器中備用[4]。

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品烘干28 h至恒重，待用。將0.022 1 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放入50 mL容量瓶中，用40%的乙醇配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25 mL容量瓶中，加入2.5 mL 2%三氯化鋁，再用40%的乙醇進(jìn)行定容，搖勻，靜置25 min。測(cè)定提取液在400 nm波長處的吸光度，記錄結(jié)果并繪制標(biāo)曲。求得回歸曲線方程：A=0.265 1C+0.002 6（0.993 8）。其中，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)。

1.4.3 試驗(yàn)步驟

取2 g烘干至恒重的辣木籽粉末，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇，再經(jīng)過不同的超聲波時(shí)間、水浴鍋溫度、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比的條件處理，靜置15 min使其冷卻，取上層清液（使用4 000 r/min離心20 min），提取一定量待測(cè)溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。

其中，單因素設(shè)定：超聲波提取時(shí)間為20，30，40，50和60 min；料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；水浴鍋溫度為30，40，50，60和70 ℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%和80%；離心提取次數(shù)為1，2，3，4和5次。按照設(shè)定條件分別進(jìn)行試驗(yàn)，提取最適宜條件，再通過3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件，將單因素試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果與Box-Behnken中心組合試驗(yàn)相結(jié)合，分別選取料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）以及超聲時(shí)間（C）3個(gè)自變量，以辣木籽中總黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在水浴鍋溫度50 ℃，料液比1∶10（g/mL）的固定條件下，超聲提取時(shí)間分別設(shè)置為20，30，40，50和60 min，不同超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 超聲提取時(shí)間變化對(duì)辣木籽黃酮提取率的影響

由圖1可知，超聲提取時(shí)間以50 min為分界點(diǎn)，起初辣木籽黃酮得率不斷上升，在超過50 min時(shí)，趨勢(shì)才呈現(xiàn)下降。這種情況是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間過短時(shí)，辣木籽中的黃酮類物質(zhì)溶解較少，析出率低；但隨著時(shí)間的增加，超聲波的空化作用及機(jī)械振動(dòng)作用導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，因此提取率上升[4]。但當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min時(shí)可能導(dǎo)致辣木籽細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)析出，影響總黃酮的純度。同時(shí)，長時(shí)間的提取也會(huì)導(dǎo)致少量乙醇揮發(fā)，從而降低總黃酮的得率。綜上所述，超聲提取時(shí)間為50 min時(shí)提取效果最好。

2.1.2 料液比對(duì)辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在超聲波時(shí)間為30 min，提取溫度為50 ℃的固定條件下，料液比分別設(shè)置為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL），不同料液比對(duì)黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 料液比變化對(duì)辣木籽黃酮提取率的影響

隨著乙醇用量的不斷增多，乙醇充分溶解了辣木籽中的黃酮類物質(zhì)，最佳溶解狀態(tài)是料液比1∶10（g/mL）。之后再不斷增加液料比，辣木籽中黃酮類物質(zhì)的得率反而出現(xiàn)波動(dòng)式下降趨勢(shì)，可能是固液比的增多使黃酮類物質(zhì)充分溶解的同時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致一些其他雜質(zhì)成分析出，影響黃酮物質(zhì)的純度，從而使總黃酮提取率降低，因此最佳料液比為1∶10（g/mL）。

2.1.3 提取溫度對(duì)辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取劑，在料液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間30 min的條件下，提取溫度分別設(shè)置為30，40，50，60和70 ℃，提取溫度的變化對(duì)黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度變化對(duì)辣木籽黃酮提取率的影響

由圖3可知，在初始階段，溫度過低不利于辣木籽內(nèi)部物質(zhì)的析出，提取率不高。隨著溫度的升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加劇，黃酮提取率也不斷升高，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值，這是由于黃酮類化合物在乙醇中的溶解度隨溫度的升高而增加，隨著溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，提取劑的滲透能力也相應(yīng)增強(qiáng)，使有效成分浸出速率增大[5]。此時(shí)辣木籽物料內(nèi)部得到充分沸騰，強(qiáng)化了傳質(zhì)過程，使提取效果達(dá)到最佳。溫度超過50 ℃時(shí)，提取率開始下降，這是由于乙醇的沸點(diǎn)是78 ℃，當(dāng)溫度不斷升高接近至沸點(diǎn)時(shí)，乙醇揮發(fā)影響黃酮的提取。綜合考慮，選取50 ℃為最佳提取溫度。2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，在超聲時(shí)間30 min，料液比1∶10（g/mL），提取溫度50 ℃的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為40%，50%，60%，70%和80%，乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對(duì)辣木籽中的總黃酮提取率的影響如4所示。

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～70%的范圍內(nèi)時(shí)，辣木籽總黃酮的提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比，在體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取率最高，超過70%之后，提取率隨體積分?jǐn)?shù)上升而下降，可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)升高導(dǎo)致少量醇溶性物質(zhì)析出，從而影響辣木籽中黃酮物質(zhì)的溶解度[6]。因此，選取體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取劑。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)變化對(duì)辣木籽黃酮提取率的影響

2.1.5 離心次數(shù)對(duì)辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間30 min，提取溫度50 ℃的條件下，離心次數(shù)分別設(shè)置為1，2，3，4和5次，不同離心次數(shù)對(duì)辣木籽中的總黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)變化對(duì)辣木籽黃酮提取率的影響

從圖5可以看出，離心次數(shù)對(duì)黃酮提取率有一定影響，隨著離心次數(shù)的增加，黃酮物質(zhì)析出率也不斷增加，在第5次時(shí)取到最大值[7-8]。可能是因?yàn)橄鄬?duì)一定量的提取溶劑，其所能溶解的黃酮類化合物的量是相對(duì)應(yīng)的，但隨著離心次數(shù)的增加，得到的上清液雜質(zhì)較少，檢測(cè)到的黃酮物質(zhì)也隨之增多。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化辣木籽總黃酮提取條件

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，具體結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.2 回歸方程建立及模型方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件，對(duì)表2進(jìn)行擬合后，得到總黃酮含量（Y）的二次回歸方程：Y=8.64-0.99A+3.37B+0.86C-0.91AB+1.80AC+0.63BC-1.45A2- 2.57 B2-1.32 C2，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析及顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，失擬=0.381 4（P＞0.05）不顯著，說明該模型具有較高擬合度和可信度，使用該方程進(jìn)行試驗(yàn)分析是可行的。F=43.73，P＜0.01，由此可得該模型極為顯著。料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互為0.028 3（P＜0.05），差異高度顯著；料液比與超聲時(shí)間交互為0.000 9（P＜0.01），差異極顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互為0.095 9（P＜0.05），差異顯著。采用Design-Expert 8.0.6軟件建立模型，并將表3中具體數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為3D曲面圖（詳見圖6～圖8）。由表2和表3可知，影響辣木籽中總黃酮得率由高到低的順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（B）＞料液比（A）＞超聲時(shí)間（C）。

圖6 料液比與超聲時(shí)間的響應(yīng)面3D模型圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的響應(yīng)面3D模型圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的響應(yīng)面3D模型圖

2.2.3 響應(yīng)面法的可靠性驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.0.6軟件建立模型，通過響應(yīng)面分析并優(yōu)化，預(yù)測(cè)的總黃酮提取率為8.481%，將模型預(yù)測(cè)的條件取整數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)76%，料液液比為1∶15（g/mL），超聲波時(shí)間為60 min。并對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的辣木籽總類黃酮提取率為8.361%±0.015%，與預(yù)測(cè)值基本一致，由此可得，該響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助水浴提取辣木籽總黃酮的工藝較具有一定可行性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助水浴法對(duì)提取辣木籽總黃酮的工藝優(yōu)化進(jìn)行探討。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明，料液比、超聲波提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類化合物提取率的影響最為顯著，且由強(qiáng)到弱依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲波時(shí)間。結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)76.04%的無水乙醇為提取溶液，固液比為1∶15（g/mL），超聲波提取時(shí)間為60 min時(shí)，辣木籽中的黃酮化合物得率達(dá)到最高。在上述條件下，辣木籽總類黃酮提取率可達(dá)到8.361%±0.015%，理論值為8.481%，結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本一致，證明了模型的有效性，工藝穩(wěn)定可行。