金橘抗氧化活性譜效關(guān)系

鄧華明，黃華花，陳景海，王曉瑩

1. 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理與健康學(xué)院（廣州 510663）；2. 廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門市中藥生物工程重點實驗室/福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品開發(fā)重點研究室（廈門 361023）；3. 廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，廈門市婦幼保健院中藥房（廈門 361003）

隨著人們對安全性的要求不斷提高，從中藥中尋求天然抗氧化劑倍受關(guān)注，測定其抗氧化活性也成為抗氧化研究的熱門話題。

金橘（kumquat），為蕓香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果實，是一種具有很大開發(fā)潛力的藥用保健資源?！吨腥A本草》記載，金橘具有理氣解郁、消食化痰、醒酒的功效[1]?，F(xiàn)有研究表明[2-6]，金橘具有抗氧化作用，揮發(fā)油、萜類、黃酮類、多糖類、甾醇類等化學(xué)成分是金橘抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

金橘的抗氧化研究僅局限于有效部位，而各部位化學(xué)成分復(fù)雜，抗氧化活性成分的篩選研究工作量大，因此試驗在前期金橘指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上[8]，探討金橘抗氧化活性的譜效關(guān)系，初步篩選與抗氧化活性密切相關(guān)的組分，為后期金橘抗氧化活性成分的篩選研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie 2，F(xiàn)1-01620 Vantaa，F(xiàn)inland）；電子天平CP124C[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

過硫酸鉀、甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；2, 2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽、1, 1-二苯基-2-苦基肼（上海源葉生物科技有限公司）；維生素C[石藥集團維生藥業(yè)（石家莊）有限公司]。藥材信息見表1，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院鮑紅娟副教授鑒定為金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]正品。

表1 金橘的樣品信息

1.2 研究方法

1.2.1 供試品溶液配制備

金橘果實，粉碎，過0.425 mm（40目）篩，精密稱定0.5 g，加25 mL 75%甲醇，稱定，超聲（900 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定，補足，搖勻，濾過，即得。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定[9]

1.2.2.1 DPPH溶液配制

取適量DPPH，精密稱定，加75%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度0.04 mg/mL的DPPH儲備液[10]。

1.2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定及IC50的計算

將供試品S1～S8的質(zhì)量濃度設(shè)定為5.000，2.500，1.250，0.625，0.313和0.156 mg/mL，維生素C溶液作為陽性對照溶液。分別取維生素C溶液、供試品溶液各100 μL，加100 μL DPPH溶液，置96孔板中，混勻，室溫避光30 min。在517 nm波長處測定吸光度Ai，同時測定各供試品溶液100 μL+75%甲醇100 μL的吸光度Aj，75%甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度A0，清除率按式（1）計算。

因不同濃度供試品的自由基清除率與濃度不呈線性，故使用SPSS Statistics 24中Probit方法進行回歸，擬合方程Probit（P）=截距+Bx，通過卡方檢驗得到IC50值。

1.2.3 ABTS自由基清除能力測定[11]

1.2.3.1 ABTS溶液配制

分別取適量ABTS、K2S2O4，精密稱定，用蒸餾水溶解并制成濃度7 mmol/L的ABTS和350 mmol/L K2S2O4溶液。取440 μL K2S2O4溶液加入到ABTS溶液中，搖勻，避光12～16 h，用75%甲醇稀釋至吸光度0.6～0.8。

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力的測定及IC50的計算

供試品濃度的設(shè)定見表2。按1.2.2.2的方法在波長734 nm下測定，計算清除率及IC50。

表2 8批金橘樣品的質(zhì)量濃度

1.2.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析法

通過Excel處理數(shù)據(jù)[12]，采用GRA法對8批金橘樣品指紋圖譜共有峰峰面積數(shù)據(jù)和自由基清除作用做統(tǒng)計分析，研究兩者的相關(guān)性。將各批次藥材的IC50設(shè)為母序列，將24個共有峰設(shè)定為子序列，1～24個共有峰分別用X1～X24表示[13]。

1.2.4.1 原始數(shù)據(jù)無量綱化

母序列、子序列分別定為A0(m)、Ai(m)，平均值分別定為，數(shù)據(jù)均值化處理，按式（2）和（3）計算，得均值化數(shù)列，新的數(shù)據(jù)中，母序列、子序列分別定為Y0(m)、Yi(m)。

1.2.4.2 求絕對差序列

按式（4）計算，得絕對差序列Δσi(m)。

1.2.4.3 求關(guān)聯(lián)系數(shù)

山東運河區(qū)域，一般是指明清時期，京杭大運河流經(jīng)山東境內(nèi)的部分州縣及其輻射地帶，大致包括今天的棗莊、濟寧、聊城等3個地級市，包含德州的德城、陵縣、武城、夏津、平原等縣級地區(qū)，以及菏澤市東部單縣、巨野、運城，泰安市的東平縣，濟南市的平陰縣等近40個縣市。明代以前，在京杭運河的重要組成部分“會通河”疏浚之前，山東運河區(qū)域的社會經(jīng)濟水平與臨近的華北地區(qū)差別不大。隨著幾代統(tǒng)治者的大力開鑿、疏浚和重整，從元末明初到之后將近400余年的時間里，隨著運河航運的便利，山東運河區(qū)域的煙草生產(chǎn)、棉花種植、果品栽培等活動也因大運河的南北通達、易于轉(zhuǎn)售而促使地方經(jīng)濟獲得了結(jié)構(gòu)性的調(diào)整和躍升。

按式（5）計算，得相應(yīng)的關(guān)聯(lián)系數(shù)L0i(k)。其中，Δmin為最小值，Δmax為最大值，ρ為分辨系數(shù)（ρ= 0.5）。

1.2.4.4 計算關(guān)聯(lián)度

按式（6）計算，得關(guān)聯(lián)度R0i。其中，N為數(shù)據(jù)個數(shù)。

1.2.4.5 排關(guān)聯(lián)序并進行譜效相關(guān)性

將關(guān)聯(lián)度進行排列，形成關(guān)聯(lián)序，反映各個子序列對母序列的“貢獻”程度。由此可確定指紋圖譜共有峰所代表的化學(xué)成分與抗氧化活性間的聯(lián)系。

1.2.5 偏最小二乘回歸分析法

利用SIMCA-P 14.1軟件，將金橘樣品指紋圖譜共有峰的峰面積與金橘的IC50進行PLSR分析，將共有峰峰面積定為X，藥材IC50定為Y。1～24個共有峰分別用X1～X24表示[14]。

1.2.5.1 建立工程，指定工作集

1.2.5.2 指定模型，進行擬合

建立工程后，系統(tǒng)根據(jù)用戶已指定的因變量Y，也就是各批金橘樣品的IC50自動生成PLSR模型。

1.2.5.3 預(yù)測分析

擬合模型后，指定預(yù)測數(shù)據(jù)集，進行擬合分析，得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 前期指紋圖譜研究[8]

前期指紋圖譜研究得8批金橘樣品的UPLC圖譜，見圖1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行分析，確定共有24個峰，見圖2。

圖1 8批金橘樣品的UPLC疊加指紋圖譜

圖2 8批金橘樣品的UPLC對照指紋圖譜

2.2 DPPH自由基清除能力測定

2.2.1 金橘樣品對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果

8批金橘樣品對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖3和圖4。結(jié)果顯示，8批金橘樣品均表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除能力，而且清除作用隨著金橘供試品質(zhì)量濃度的升高而增強，同時S3和S8分別表現(xiàn)出相對最強和相對最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的強弱順序為S3＞S4＞S7＞S1＞S2＞S5＞S6＞S8。

圖3 8批金橘樣品和VC對DPPH自由基的清除能力

圖4 8批金橘樣品和VC的DPPH自由基清除作用IC50

2.2.2 金橘指紋圖譜與DPPH自由基清除能力的譜效關(guān)系分析

2.2.2.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

GRA分析結(jié)果，見表3。根據(jù)關(guān)聯(lián)序，確定各色譜峰對金橘抗氧化作用貢獻的大小，依次為X2＞X1＞X9＞X14＞X6＞X12＞X19＞X11＞X10＞X16＞X15＞X5＞X22＞X3＞X17＞X23＞X4＞X20＞X24＞X18＞X8＞X21＞X13＞X7，其中X2、X1、X9、X14、X6、X12、X19、X11、X10、X16的相對關(guān)聯(lián)度均大于0.65，對清除自由基作用的貢獻較明顯。

表3 金橘樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關(guān)聯(lián)度

2.2.2.2 偏最小二乘回歸分析

PLSR分析結(jié)果，見圖5。擬合回歸方程：Y=-0.112X1-0.244X2-0.029X3+0.066X4-0.057X5+ 0.062X6+0.010X7+0.034X8-0.167X9-0.242X10+ 0.111X11-0.165X12+0.050X13-0.064X14-0.045X15- 0.001X16+0.053X17-0.005X18-0.291X19+0.078X20+ 0.001X21-0.013X22+0.008X23-0.041X24。相關(guān)系數(shù)的絕對值反映對金橘抗氧化作用的貢獻，絕對值越大，對金橘抗氧化貢獻越大；反之，絕對值越小，對金橘抗氧化作用貢獻越小。其中，色譜峰X1、X2、X3、X5、X9、X10、X12、X14、X15、X16、X18、X19、X22、X24呈負(fù)相關(guān)，因IC50與金橘的抗氧化作用呈負(fù)相關(guān)，所以這些色譜峰對金橘抗氧化作用有貢獻。

圖5 8批金橘樣品的PLSR標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)圖和VIP值圖

變量投影（VIP），是直接反映金橘指紋圖譜中的各色譜峰對金橘抗氧化活性貢獻程度的一個參數(shù)，VIP值越大，說明該峰所代表的化合物對金橘抗氧化作用的影響程度越高，VIP＞1時，表示對金橘抗氧化作用有顯著貢獻。色譜峰X19、X2、X9、X12、X10、X1、X14、X5的VIP值＞1，因此，金橘樣品指紋圖譜中X1、X2、X5、X9、X10、X12、X14所代表的化合物，可能為金橘抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 ABTS自由基清除能力測定

2.3.1 金橘樣品對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果

8批金橘樣品對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果見圖6和圖7。結(jié)果顯示，8批樣品均對ABTS自由基表現(xiàn)出明顯清除作用，且清除作用隨質(zhì)量濃度升高而增強，同時S1和S8分別表現(xiàn)出相對最強和相對最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的強弱順序為S1＞S3＞S4＞S2＞S5＞S6＞S7＞S8。

圖6 8批金橘樣品和VC對ABTS自由基的清除能力

圖7 8批金橘樣品和VC的ABTS自由基清除作用IC50

2.3.2 金橘指紋圖譜與ABTS自由基清除能力的譜效關(guān)系分析

2.3.2.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

GRA分析結(jié)果，見表4。依據(jù)關(guān)聯(lián)序，確定各色譜峰對金橘抗氧化作用貢獻程度，順序依次為X19＞X2＞X16＞X20＞X17＞X23＞X22＞X24＞X21＞X8＞X18＞X3＞X13＞X15＞X5＞X11＞X10＞X1＞X4＞X6＞X7＞X5＞X14＞X19，其中X19、X2、X16、X20、X17、X23、X22、X24、X21的相對關(guān)聯(lián)度均大于0.8，對清除自由基作用的貢獻較明顯。

表4 金橘樣品UPLC指紋圖譜與清除ABTS自由基活性關(guān)聯(lián)度

2.3.2.2 偏最小二乘回歸分析

PLSR分析結(jié)果，見圖8。擬合回歸方程：Y= -0.066X1-0.612X2-0.034X3+0.272X4+0.090X5+0.231X6- 0.000 2X7-0.546X8+0.095X9-0.356X10+0.005X11+ 0.003X12+0.028X13-0.223X14+0.156X15-0.111X16+ 0.066X17-0.126X18-0.241X19+0.094X20-0.068X21+ 0.004X22+0.099X23+0.020X24?；貧w系數(shù)為負(fù)數(shù)的色譜峰是抗氧化能力的貢獻峰，其中，色譜峰X1、X2、X3、X7、X8、X10、X14、X16、X18、X19、X21呈負(fù)相關(guān)，對金橘抗氧化作用有貢獻。

圖8 8批金橘樣品的PLSR標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)圖和VIP值圖

色譜峰X2、X19、X10、X8、X1、X14、X11的VIP值＞1，因此，金橘樣品指紋圖譜中X1、X2、X8、X10、X14、X19代表的化合物可能為金橘抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論與結(jié)論

3.1 分析方法的選擇

灰色關(guān)聯(lián)度分析法是衡量各因素之間關(guān)系的統(tǒng)計方法，對數(shù)據(jù)的要求較為低，而且可以減少由于數(shù)據(jù)不對稱帶來的影響，偏最小二乘回歸分析法是集多種方法于一身的統(tǒng)計方法，可以較好地解決樣本少于變量個數(shù)的問題。這2種方法都是通過統(tǒng)計各色譜峰峰面積與藥效間的聯(lián)系，評價兩者的相關(guān)性和貢獻值大小的統(tǒng)計方法，上述2種方法均是構(gòu)建中藥譜效關(guān)系常用、有效的方法，同時選用2種方法進行分析，結(jié)果更全面、客觀。

3.2 DPPH儲備液濃度的確定

預(yù)試驗過程中，制備的DPPH儲備液質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL，此時所測得的金橘供試品均未表現(xiàn)出抗氧化活性，說明可能DPPH儲備液濃度過高，導(dǎo)致各濃度金橘供試品自由基清除率偏低，未表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，因此將DPPH儲備液的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.04 mg/mL，結(jié)果表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

試驗在前期指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，通過DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法評價8批不同產(chǎn)地的金橘樣品的抗氧化活性，采用GRA和PLSR構(gòu)建金橘抗氧化活性的譜效關(guān)系。GRA和PLSR結(jié)果均表明，X2、X19的峰面積與DPPH和ABTS自由基清除能力呈正相關(guān)，可能為金橘抗氧化的貢獻峰，其代表的化合物可能為金橘抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。該試驗為后期金橘抗氧化活性成分的篩選研究提供參考，為金橘的深度研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。