蛋黃親脂抗氧化組分對脂質自動氧化抑制作用

齊海雯，都玉玉，張書堯，任戈一，冰瑪拉措，王慶玲

石河子大學食品學院（石河子 832003）

雞蛋作為一種質優價廉的高蛋白營養品，深受我國廣大居民喜愛。但由于蛋黃中含有大量脂質，在貯藏過程中脂質容易發生水解及氧化[1]，導致雞蛋品質下降。脂質氧化分為酶促氧化、非酶及自由基介導的氧化和非酶及非自由基氧化，其中自由基參與的氧化與體內的氧化應激密切相關[2-3]。脂質自動氧化不僅產生有害物質還會累積自由基，促進氧化循環生成鏈式反應[4]。脂質氧化反應所產生的自由基具有強氧化性、活度高和穩定性差的特點，易與周圍分子反應，對機體產生損傷[5-6]。相關研究表明一般誘導脂質氧化的自由基為羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2

-·）[7]。

蛋黃由于含有內源抗氧化系統，會產生大量內源抗氧化物質[8]，可抵抗自由基的攻擊，降低對機體的損傷。雞蛋中除卵黃高磷蛋白、卵轉鐵蛋白、游離芳香族氨基酸等，還有一些親脂性抗氧化成分，如維生素E、類胡蘿卜素、磷脂等。研究表明雞蛋在常溫狀態下能儲存較長時間，而蛋黃中的脂質氧化速率較慢，可能與蛋黃內源抗氧化體系有關[9]。

為探究蛋黃內源抗氧化物質對脂質氧化的抑制作用，試驗以油酸/亞油酸為底物，分別建立羥自由基和超氧陰離子自由基自動氧化模擬體系，探究不同因素對脂質自動氧化的影響，明確蛋黃主要親脂組分磷脂（PL）、蛋黃類胡蘿卜素（Cars）及磷脂-類胡蘿卜素乳液（PCE）對脂質氧化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋（產蛋24 h內，購于石河子市宏鑫養殖場）；正己烷、硫酸亞鐵、過氧化氫、硫代巴比妥酸（國藥集團化學試劑有限公司）；亞油酸、油酸、過氧化氫異丙苯（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

Neofuge-15R酶標儀（美國伯爵儀器有限公司公司）；Multifuge?XIR高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；SH21-1恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；DK-8D恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋黃磷脂（PL）的提取

參考Ali等[10]的方法。40 g蛋黃與120 mL乙醇渦旋混勻后低溫離心，上清液移至燒杯。重復提取1次，合并上清液并回收溶劑。60 mL正己烷溶解濃縮物后加入120 mL -20 ℃丙酮，磁力攪拌至PL沉淀，低溫丙酮（10 mL/次）洗滌沉淀2次，氮氣吹干獲得蛋黃PL，乙醇溶解后于4 ℃保存備用。

1.3.2 蛋黃類胡蘿卜素（Cars）的提取

3 g蛋黃與9 mL混合溶液（V甲醇∶V乙酸乙酯∶V石油醚= 1∶1∶1）渦旋混勻1 min，重復提取3次，合并上清液氮氣吹干。沉淀用6 mL溶液（V叔丁基甲基醚∶V乙醇=3∶1）復溶后過0.45 μm微孔濾膜制得蛋黃Cars，于4 ℃保存備用[11]。

1.3.3 磷脂-類胡蘿卜素乳液（PCE）的制備

參考Tan等[12]的方法并略作修改。將0.03 g Cars溶于6 mL乙醇（含有3 g PL）溶液中獲得磷脂-類胡蘿卜素乳液溶液，加入60 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.15 mol/L氯化鈉，2.16 g吐溫80）配成磷脂-類胡蘿卜素混合液，旋轉蒸發乙醇后以14 000 r/min高速剪切5 min制得PCE，于4 ℃保存備用。

1.3.4 羥自由基氧化體系的建立

在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，1 mg/mL吐溫20）中添加FeCl3和抗壞血酸鈉，使其最終濃度分別為0.1 mmol/L及0.1 mmol/L，通過高錳酸鉀法測定H2O2濃度，分別調節H2O2濃度至0，1，2，10，20，30和40 mmol/L。

1.3.5 超氧陰離子自由基氧化體系的建立

超氧陰離子由黃嘌呤氧化酶（XO）作用于黃嘌呤（X）產生。在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.2，1 mg/mL吐溫20）中加入X/XO（X∶XO=40 mmol/L∶1 U，U為XO酶活力單位），使超氧陰離子自由基最終濃度分別0，1，2，10，20，30和40 mmol/L。

1.3.6 不同自由基及濃度對脂質氧化的影響

向含有不同濃度羥自由基及超氧陰離子自由基的氧化體系中分別添加油酸、亞油酸和蛋白質，使油酸、亞油酸終濃度10 mg/mL，于4 ℃孵育12 h后分別測定表征脂質氧化的HPOD值和TBARS。

1.3.7 底物濃度對脂質氧化的影響

將油酸、亞油酸加入10 mmol/L羥自由基氧化體系中，使油酸、亞油酸終濃度分別為1，3，5，10，20，30和50 mg/mL，于4 ℃孵育12 h后用BHT終止反應，測定表征脂質氧化的HPOD值和TBARS值。

1.3.8 抗氧化物濃度對脂質氧化的影響

將油酸、亞油酸分別加入濃度為10 mmol/L羥自由基氧化體系中混合，使油酸、亞油酸終濃度為10 mg/mL，迅速添加不同濃度（0，2，4，6，8，10和12 mg/mL）的PL、Cars及PCE渦旋振蕩，在4 ℃環境中反應12 h后用BHT終止反應，測定HPOD值及TBARS值。

1.3.9 脂質氫過氧化物（HPOD）測定

0.1 mL試樣溶液與1.5 mL的異辛醇-異丙醇（3∶1，V/V）溶液渦旋均質3次（每次10 s）。后將溶液于3 400 r/min離心2 min，取0.2 mL上清液加入到2.8 mL混合溶液中（V甲醇∶V丁醇=2∶1）。分別加入15 μL硫氰酸銨（3.94 mol/L）溶液和15 μL Fe2+溶液（通過混合0.132 mol/L BaCl2和0.144 mol/L FeSO4獲得），20 min后510 nm處測定吸光度。標準曲線用過氧化氫異丙苯定量，結果表示為mg HPOD/mL。

1.3.10 TBARS值測定

脂質次級氧化產物丙二醛與硫代巴比妥酸（TBA）發生反應，通過TBARS值得到丙二醛含量，但是TBARS值不等于次級氧化產物。因此，將適量試樣與三氯乙酸混合后加入硫代巴比妥酸（TBA）溶液，于90 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，532 nm處測得吸光度，計算TBARS含量[11]。

1.4 數據處理方法

每組試驗重復3次測定，組間數據采用SPSS Statistics 17.0進行差異顯著性分析（P＜0.05），結果用平均值±標準差（X±SD）的形式進行表示，運用Origin Pro 8.5軟件進行圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 模擬氧化體系中不同自由基種類及濃度下油酸氧化的比較

2.1.1 不同濃度·OH對油酸氧化程度的影響

由圖1可知，羥自由基濃度在0～10 mmol/L的范圍內，油酸的HPOD及TBARS含量顯著增加（P＜ 0.05），而濃度在10～40 mmol/L范圍內，氧化產物含量顯著減少（P＜0.05）。低濃度時油酸氧化產物增加，其原因是底物油酸結構中的不飽和雙鍵易被羥自由基攻擊導致脫氫，隨后分解產生丙二醇，HPOD和TBARS正是表征衡量次級氧化產物丙二醇含量的指標[3]。氧化體系中羥自由基濃度大于10 mmol/L時，羥自由基會發生聚集結合的現象使其有效濃度降低，從而表現出油酸氧化程度下降的現象[11]。

圖1 不同濃度羥自由基氧化體系對油酸氧化的影響

2.1.2 不同濃度O2-·自由基對油酸氧化程度的影響

由圖2可知，油酸的脂質初級氧化產物及次級氧化產物含量表現出逐漸上升趨勢。與圖1相比，在相同自由基濃度下，羥自由基對油酸氧化產生的HPOD及TBARS含量總體高于超氧陰離子，表明羥自由基體系對油酸的氧化誘導作用更顯著。有研究表明羥自由基比超氧自由基具有更大的氧化活性，其氧化電位達2.8 V，且能透過細胞膜對細胞內部造成嚴重的氧化損傷。因此，在羥自由基氧化體系中，油酸HPOD及TBARS高于超氧陰離子體系。

圖2 不同濃度超氧陰離子自由基氧化體系對油酸氧化的影響

2.2 模擬氧化體系中不同自由基種類及濃度下亞油酸氧化的比較

2.2.1 不同濃度的·OH對亞油酸氧化程度的影響

由圖3可知，以亞油酸為底物，·OH濃度在0～10 mmol/L范圍內，HPOD及TBARS含量隨羥自由基濃度增加而顯著上升（P＜0.05）。·OH濃度在10～40 mmol/L范圍內，脂質氧化產物隨濃度增加而顯著降低（P＞0.05）。與油酸體系類似，亞油酸的大量不飽和雙鍵易被羥自由基攻擊脫氫，隨后分解形成產生的丙二醇，通過測定HPOD和TBARS等衡量次級氧化產物丙二醇含量的指標得到其含量[3]。羥自由基濃度大于10 mmol/L時，部分羥自由基會形成聚合物導致鏈式反應作用減弱，因而表現出亞油酸氧化程度下降的現象[11]。

圖3 不同濃度羥自由基氧化體系對亞油酸氧化的影響

2.2.2 不同濃度O2-·對亞油酸氧化程度的影響由圖4可知，隨著O2-·濃度增加，亞油酸的脂質初級氧化產物及次級氧化產物含量表現出逐漸上升趨勢，但氧化產物含量顯著低于羥自由基體系，因此·OH誘導的亞油酸氧化作用效果更強。

圖4 不同濃度超氧自由基氧化體系對亞油酸氧化的影響

結果表明，羥自由基對油酸和亞油酸的氧化誘導作用顯著高于超氧陰離子，因此選擇·OH體系作為后續研究的氧化模擬體系。

2.3 底物濃度對模擬氧化體系中脂質氧化的影響

由圖5可知，羥自由基氧化體系下脂質氧化指標HPOD和TBARS含量變化規律基本一致，兩者含量隨底物濃度增加而逐漸升高，而當油酸和亞油酸濃度在10 mg/mL及以上時趨于穩定。張迎陽[13]的研究同樣發現亞油酸氧化程度在一定范圍內隨底物濃度增加而升高。底物濃度在1～10 mg/mL范圍內時，脂質氧化程度顯著加深[圖5（a），P＜0.05]，這是由于·OH與脂質發生脂質鏈式氧化反應所致并生成初級脂質氧化產物及次級脂質氧化產物，在一定范圍內底物濃度越高，鏈式反應的發生量越大，從而導致氧化產物的積累量增加。底物濃度大于10 mg/mL時，脂質氧化程度隨底物濃度增加基本保持平穩，這可能是因為氧化體系中·OH的氧化能力與底物濃度基本趨于平衡，表現出脂質氧化程度小幅波動的現象[14]。

圖5 不同底物濃度對油酸、亞油酸氧化的影響

2.4 PL、Cars和PCE對模擬氧化體系中脂質氧化的影響

圖6為不同蛋黃抗氧化組分對羥自由基氧化模擬體系中油酸、亞油酸的氧化抑制效果。抗氧化組分的添加對羥自由基誘導的脂質氧化表現出顯著的抑制效果（P＜0.05），隨抗氧化物濃度增加，抑制效果逐漸增強，在6 mg/mL時基本趨于平穩。這可能是由于隨抗氧化物濃度的增加，體系內的抗氧化能力逐漸增強，油酸和亞油酸遭受羥自由基的氧化風險逐漸降低。但是亞油酸體系中氧化與抗氧化平衡點大于油酸體系中的平衡點，造成此現象的原因可能是亞油酸不飽C＝C雙鍵含量遠高于油酸的不飽和程度[15]。

由圖6可知，PCE對油酸抗氧化效果最強，原因可能是PL是雙親性分子，可形成PL雙分子層包裹疏水性分子[12]，PL在乳液中以PL雙分子層的形式將Cars包裹于雙分子層空腔中，并通過疏水性尾部吸附在油酸分子表面形成抗氧化層大幅降低油酸的氧化風險。此外，Cars的抗氧化效果強于PL。這可能是Cars中的多種抗氧化物質共同發揮抗氧化作用的結果。有研究表明Cars中葉黃素的結構以共軛雙鍵為主并輔以2個紫羅酮環二羥基，其天然存在的紫羅酮環二羥基賦予葉黃素較高的氧自由基清除能力[16-17]。此外，任丹丹等[18]證實Cars中葉黃素與玉米黃質存在協同抗氧化的現象。蛋黃PL主要由磷脂酰膽堿（PC，占磷脂84%）構成，因其含有大量不飽和C＝C雙鍵導致PL結構不穩定，易被氧自由基攻擊致使抗氧化性能減弱。

圖6 不同抗氧化物濃度對油酸、亞油酸氧化的影響

3 結論

研究表明蛋黃內源抗氧化組分的添加對油酸和亞油酸自動氧化具有顯著抑制作用，并且隨著抗氧化物濃度增加，抑制氧化效果逐漸增強。其中，PCE對脂質抗氧化效果最強，可能是PL包裹Cars并通過疏水性尾部吸附在油酸分子表面形成抗氧化層顯著降低油酸自動氧化效果。試驗證實蛋黃親脂抗氧化組分對脂質自動氧化具有抑制作用，并為PL和Cars協同調控脂質自動氧化進程提供依據。