冷藏中國(guó)對(duì)蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

倪榮，齊懿涵，馬曉璐，何惠利，張振，郭雪松

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）是著名的對(duì)蝦品種，含有多種人體所需營(yíng)養(yǎng)成分，其蛋白質(zhì)含量高，富含維生素等特點(diǎn)，然而蝦類在捕撈、運(yùn)輸、販賣過程中極易受到微生物的影響發(fā)生黑變、腐敗，在蝦體繁殖的微生物隨著時(shí)間的增加而增加，會(huì)產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)腐敗菌（specifific spoilage organism，SSO），加速產(chǎn)品腐敗。

冷藏是水產(chǎn)品中常用的保鮮方法，在4 ℃條件下，會(huì)產(chǎn)生特定的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，加速產(chǎn)品的腐敗。Duan等[1]利用PCR-DGGE方法研究羅非魚片在4 ℃貯藏下的微生物群的演替規(guī)律，最終SSO為假單胞菌屬（Pseudomonas）在整個(gè)貯藏期間占據(jù)優(yōu)勢(shì)、Shewanella和Psychrobacter也在3 d后始終存在是優(yōu)勢(shì)菌。Lan等[2]研究表明，墨魚在4 ℃冷藏下的微生物多樣性變化，最終在腐敗末期，主要優(yōu)勢(shì)菌是Pseudomonas fragi29.5%，Pseudomonas. fluorescens33.4%，Shewanella putrefaciens32.0%，Staphylococcus sciuri5.1%。Sun等[3]結(jié)果表明在4 ℃貯藏下，腐敗草魚中假單胞菌（Pseudomonas）、腐敗希瓦菌（Shewanella）和氣單胞菌（Aeromonas）是草魚魚片的主要腐敗菌。

試驗(yàn)選擇傳統(tǒng)培養(yǎng)基法，利用菌落形態(tài)特征，并通過細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)合16S rDNA分子鑒定出中國(guó)對(duì)蝦貯藏末期的腐敗菌。將SSO接種到無菌蝦肉上，以pH、菌落總數(shù)（TVC）、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和腐敗物質(zhì)產(chǎn)量YTVB-N/(CFU)值作為腐敗評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析不同腐敗菌的致腐能力，得到在4 ℃貯藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，為中國(guó)對(duì)蝦腐敗機(jī)理的探索和保鮮劑開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

中國(guó)對(duì)蝦（鮮活，大小均勻，遼寧省錦州市水產(chǎn)品市場(chǎng)）；蛋白胨、牛肉膏、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Plate count agar，PCA，北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；細(xì)菌生化鑒定管（青島海博生物技術(shù)有限公司）；甲基紅指示劑（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；氧化鎂（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（天津市巴斯夫化工有限公司）。

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；PZHJH-112型垂直流超凈工作臺(tái)（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；HS-25臺(tái)式酸度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌落的分離和純化

將中國(guó)對(duì)蝦在新鮮活體的狀態(tài)下使用冰水混合致死，于4 ℃條件下貯藏中國(guó)對(duì)蝦到達(dá)腐敗末期（12 d）。參考Tshabalala等[4]方法采用10倍稀釋法，在紫外超凈臺(tái)的無菌條件下將完全腐敗的蝦肉放入0.85%無菌生理鹽水中，混勻制成菌懸液，選擇合適的梯度將菌液涂布于PCA，30 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算各平板的細(xì)菌菌落總數(shù)，根據(jù)菌落表面特征形態(tài)進(jìn)行分組，對(duì)各細(xì)菌進(jìn)行初步歸類，并計(jì)算同一類的菌落所占比例。挑取高比例且形態(tài)特征不同的菌落進(jìn)一步平板劃線分離純化，最終純化的菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基上，備用。

1.2.2 腐敗菌的表面特征和生理生化試驗(yàn)鑒定

對(duì)腐敗菌的單菌落的顏色、光澤、透明度等形態(tài)觀察和生理生化特征進(jìn)行鑒定，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]中關(guān)于細(xì)菌的鑒定以及生化試驗(yàn)具體方法參考《現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)手冊(cè)》[7]。

1.2.3 16S rDNA鑒定和序列分析

PCR擴(kuò)增，通用引物為27 f/1 492 r，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min連續(xù)變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃最后延伸10 mim；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增和測(cè)序送往北京美優(yōu)安諾生物科技有限公司完成，用NCBI進(jìn)行分析，選取同源性超過98%的序列，采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力定量測(cè)定

1.2.4.1 腐敗菌菌懸液制備

將分離得到的不同腐敗菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線復(fù)壯后，進(jìn)行活化。參考于淑池等[8]的方法，進(jìn)行改動(dòng)，將活化后的菌液放置在30 ℃的立式恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h左右，檢測(cè)菌液濃度達(dá)到108 CFU/mL左右。以離心機(jī)在12 000 r/min、30 min條件下，去上清，使用無菌生理鹽水將沉淀稀釋到106 CFU/mL，備用。

1.2.4.2 無菌蝦肉的制備

參考唐文靜等[9]的試驗(yàn)方法，將鮮活的中國(guó)對(duì)蝦冰水致死后，去掉蝦的頭和外殼，使用無菌水沖洗中國(guó)對(duì)蝦，使用75%乙醇擦拭中國(guó)對(duì)蝦體表面，將試驗(yàn)樣品放在無菌工作臺(tái)里，紫外照射30 min，達(dá)到無菌的狀態(tài)。

1.2.4.3 腐敗菌接種試驗(yàn)

將處理后無菌蝦肉放入制備好的各菌懸液中30 s左右，以滅菌鑷子夾出晾干，放入無菌的封口袋中，每隔3 d測(cè)1次指標(biāo)。于4 ℃條件下測(cè)定菌落總數(shù)（TVC）以對(duì)數(shù)值表示，pH和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）為腐敗指標(biāo)，以未接菌液的無菌蝦肉為對(duì)照組。

1.2.4.4 pH 測(cè)定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH的測(cè)定》[10]進(jìn)行pH測(cè)定，3次平行試驗(yàn)。

1.2.4.5 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]進(jìn)行TVC值測(cè)定，3次平行試驗(yàn)。

1.2.4.6 揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[12]測(cè)定TVB-N值，3次平行試驗(yàn)。

1.2.4.7 腐敗能力的定量測(cè)定

對(duì)不同菌的腐敗能力進(jìn)行定量分析[13]，YTVB-N/(CFU)作為評(píng)估優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗能力的指標(biāo)。按式（1）計(jì)算。

式中：（TVB-N）0代表TVB-N貯藏期開始的含量，mg/100 g；（TVB-N）S代表TVB-N貯藏期結(jié)束點(diǎn)的含量，mg/100 g；N0代表TVC貯藏期開始的含量，CFU/g；NS代表TVC貯藏期結(jié)束點(diǎn)的含量，CFU/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、Graphpad Prism 8和和Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及繪圖，不同試驗(yàn)均進(jìn)行3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)分析

通過多次進(jìn)行平板劃線分離，4 ℃冷藏下在中國(guó)對(duì)蝦完全腐敗時(shí)，經(jīng)過平板上挑選計(jì)算其占全部菌落的比例，選出4株典型腐敗細(xì)菌菌落，以數(shù)字進(jìn)行編號(hào)，見圖1，形態(tài)特征見表1。

圖1 腐敗菌分離純化

由表1可知，4株腐敗菌的菌落形態(tài)大多數(shù)為圓形、凸起、光滑、整齊，只有2號(hào)菌株為非圓、扁平、粗糙、不整齊，1～2號(hào)菌落顏色為白色，3號(hào)菌株為淡黃色，4號(hào)菌株為乳白色。

表1 不同腐敗細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

2.2 腐敗菌表面形態(tài)和生理生化試驗(yàn)測(cè)定

表2為分離純化的4株菌革蘭染色及其生理生化特征。

圖2 革蘭染色結(jié)果

表2 不同腐敗細(xì)菌的生理生化特征

革蘭染色結(jié)果表明2號(hào)菌株為陽(yáng)性，1號(hào)，3號(hào)和4號(hào)菌株為陰性；觸酶試驗(yàn)只有4號(hào)菌株為陰性，山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)都為陽(yáng)性；氧化酶試驗(yàn)1號(hào)菌株和3號(hào)菌株呈現(xiàn)陽(yáng)性、2號(hào)菌株和4號(hào)菌株為陰性；硫化氫試驗(yàn)2號(hào)菌株為陽(yáng)性，1號(hào)，3號(hào)、4號(hào)菌株陰性；L-精氨酸脫羧酶試驗(yàn)只有4號(hào)菌株為陰性；O/F試驗(yàn)1號(hào)菌株和3號(hào)菌株為產(chǎn)堿型，2號(hào)菌株和4號(hào)菌株為發(fā)酵型；明膠液化試驗(yàn)除3號(hào)菌株外都是陰性。

2.3 16S rDNA鑒定及同源性分析

2.3.1 4菌株P(guān)CR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像

采用27F/1492R通用引物，對(duì)4株冷藏中國(guó)對(duì)蝦腐敗菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1 500 bp大小的特異條帶，如電泳圖3所示。

圖3 4株腐敗細(xì)菌的16S rDNA電泳圖譜

2.3.2 16S rDNA序列的同源性分析

將冷藏條件下，篩選出中國(guó)對(duì)蝦貯藏末期的4株優(yōu)勢(shì)腐敗菌送到北京美優(yōu)安諾生物科技有限公司測(cè)序，利用NCBI進(jìn)行分析，選取同源性≥98%的菌株序列，進(jìn)行多重菌株序列比較對(duì)比構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖4所示。

由圖4結(jié)合菌株形態(tài)及生理生化試驗(yàn)可得出結(jié)果，1號(hào)菌株為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、2號(hào)菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、3號(hào)菌株為腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、4號(hào)菌株為威斯康星米勒菌（Moellerella wisconsensis）。

圖4 基于16S rDNA序列同源性的中國(guó)對(duì)蝦4株腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

試驗(yàn)與前人研究大致相似，如Wang等[14]在腐敗的冷鮮雞中分離鑒定得到4株優(yōu)勢(shì)腐敗菌：殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）和液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）。張振[15]研究冷藏中國(guó)對(duì)蝦0～12 d不同貯藏節(jié)點(diǎn)的腐敗菌，共分離得到10株細(xì)菌，通過菌相分析，得出在12 d冷藏末期的優(yōu)勢(shì)菌為Pseudomonasspp和Shewanellaspp。

2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力分析

2.4.1 pH變化

將4株優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種于無菌蝦肉后，中國(guó)對(duì)蝦冷藏期間的pH的變化結(jié)果見表3，編號(hào)依次為J（熒光假單胞菌）、F（腐敗希瓦菌）、W（威斯康星米勒菌）、D（地衣芽孢桿菌）、C（對(duì)照），下同。

如表3所示，不同組別在第0天時(shí)pH在6.57～6.68，在冷藏第3天的pH呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，到達(dá)第6天，隨著冷藏天數(shù)延長(zhǎng)，pH呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。原因是水產(chǎn)品死后，乳酸在體內(nèi)累積導(dǎo)致pH降低，體內(nèi)的蛋白質(zhì)開始逐步分解，由此產(chǎn)生大量的含氮物質(zhì)導(dǎo)致pH上升[16]。只有C組和F組在pH延緩至第6天有上升趨勢(shì)，但各組在冷藏期間都呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，從表3可以看出，J組在第12天時(shí)，pH顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），說明假單胞菌屬對(duì)分解中國(guó)對(duì)蝦蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多氨類物質(zhì)的能力更強(qiáng)。其次是F組。假單胞菌屬腐敗能力更強(qiáng)與陳冬霞[17]研究結(jié)果相符。

表3 不同菌株對(duì)中國(guó)對(duì)蝦冷藏期間pH變化的影響

2.4.2 菌落總數(shù)變化

接種不同腐敗菌后中國(guó)對(duì)蝦在冷藏條件下，TVC值的變化如圖5所示，隨著貯藏天數(shù)增加，各組別的TVC值均呈整體上升趨勢(shì)。C組在第12天時(shí)TVC值達(dá)到6.08 lg（CFU/g）已超出安全范圍，水產(chǎn)品的最高安全限制數(shù)值為6.0 lg（CFU/g）[18]，J組在第6天超出安全限值，代表已不可食用。其J組至9 d時(shí)TVC值達(dá)到6.76 lg（CFU/g），顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），第12天的J組與F組的TVC值顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），J組與F組在第6天增長(zhǎng)加快，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在12 d時(shí)J組與F組TVC值不存在顯著性差異（P＞0.05）。說明熒光假單胞菌與腐敗希瓦菌生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，是造成中國(guó)對(duì)蝦腐敗變質(zhì)的主要菌群。這一結(jié)論與楊賓等[19]研究大菱鲆優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌屬和腐敗希瓦菌一致。

圖5 不同菌株對(duì)中國(guó)對(duì)蝦冷藏期間TVC值變化的影響

2.4.3 TVB-N變化

TVB-N值是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的相應(yīng)指標(biāo)，參考GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》[20]，水產(chǎn)品的TVB-N值＞30 mg/100 g，即為腐敗變質(zhì)。接種不同腐敗菌后中國(guó)對(duì)蝦在冷藏條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)的TVB-N值的變化見圖6。

圖6 不同菌株對(duì)中國(guó)對(duì)蝦冷藏期間TVB-N值變化的影響

由圖6可知，所有接菌組的TVB-N值整體高于對(duì)照組，在0～12 d冷藏期內(nèi)，不同組別的TVB-N值均呈上升趨勢(shì)，且各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。前3 d，所有組的TVB-N值總體緩慢增加，組間TVB-N值差異不顯著，第3天各組之間上升趨勢(shì)加快，且存在顯著性差異（P＜0.05）。第6天時(shí)，對(duì)照組TVB-N值為14.7 mg/100 g，為一級(jí)鮮度，各接菌組TVB-N值均已超過30 mg/100 g，蝦肉已腐敗變質(zhì)，冷藏至12 d時(shí)J組TVB-N值達(dá)到87.75±1.07 mg/100 g，與其他組存在顯著性差異（P＜0.05），J組腐敗能力更強(qiáng)。Stohr等[21]研究表明，Pseudomonasspp.接種在無菌煙熏蛙魚表現(xiàn)出產(chǎn)TVB-N能力較強(qiáng)。

2.4.4 腐敗能力的定量測(cè)定

不同腐敗菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)條件不同，使代謝能力會(huì)產(chǎn)生不同，通過計(jì)算產(chǎn)量因子，測(cè)定4株腐敗菌的致腐能力。

由圖7可知，以TVB-N產(chǎn)量因子得到的數(shù)據(jù)為依據(jù)，確定不同菌株致腐能力的大小：J組＞F組＞W(wǎng)組＞D組。J組的產(chǎn)量因子為（1.22±0.06）×10-6mg TVB-N/CFU，高于其他組別有顯著性差異（P＜ 0.05），由此可以初步得出熒光假單胞菌為4 ℃冷藏中國(guó)對(duì)蝦的SSO。候溫甫等[22]研究表明假單胞菌屬是草魚4 ℃貯藏末期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。曹榮等[23]利用高通量測(cè)序技術(shù)，表明凡納濱對(duì)蝦在4 ℃冷藏下的優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌屬一直占高比例。試驗(yàn)結(jié)果與其他研究結(jié)果大致相同，一些菌種的不同和致腐能力不同可能與水產(chǎn)品品種不同有關(guān)。

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)基法從4 ℃冷藏下的中國(guó)對(duì)蝦腐敗的末期（12 d），分離純化獲得4株腐敗菌，結(jié)合生理生化指標(biāo)和16S rDNA技術(shù)鑒定，分別屬于熒光假單胞菌、威斯康星米勒菌、腐敗希瓦菌、地衣芽孢桿菌。對(duì)4株腐敗菌進(jìn)行致腐能力測(cè)定，熒光假單胞菌的致腐能力最高，其次是腐敗希瓦菌，地衣芽孢桿菌和威斯康星米勒菌最弱。確定熒光假單胞菌為4 ℃冷藏中國(guó)對(duì)蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，通過篩選致腐能力最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可為后續(xù)針對(duì)性抑菌試驗(yàn)和保鮮劑的選擇提供理論參考。