UPLC/MSMS快速篩查減肥類保健食品中6種違禁藥物

韓瑨烜，寇雷，李勇，萬(wàn)玉煒

1. 新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（烏魯木齊 830011）；2. 新疆職業(yè)大學(xué)（烏魯木齊 830011）

隨著人們對(duì)纖細(xì)美學(xué)的不斷追崇[1]，越來(lái)越多的減肥類保健食品被推向市場(chǎng)。然而保健食品向來(lái)是違禁藥物泛濫的重災(zāi)區(qū)，部分不法商法為賺取暴利，通過(guò)向產(chǎn)品中添加如西布曲明等具有減肥功效的非法添加物以達(dá)到快速減肥瘦脂的目的。除西布曲明外，減肥類保健食品中經(jīng)常添加的違禁藥物還包括麻黃堿[2]、芬氟拉明、酚酞以及西布曲明的衍生物N-單去甲基西布曲明和N，N-雙去甲基西布曲明等，上述藥物雖然作用機(jī)理各有不同，但都可在短期內(nèi)使受體達(dá)到減輕體重的作用，長(zhǎng)期或者過(guò)量食用均會(huì)對(duì)人體造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[3]。

目前針對(duì)保健食品中違禁藥物的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[4]、分光光度法[5]、液相色譜法[6]和液相色譜-質(zhì)譜法[7-8]，其中薄層色譜法只能做定性篩查，存在較高的假陽(yáng)性率，通常用于初篩。分光光度法干擾因素較多，定量并不準(zhǔn)確，特異性不強(qiáng)。液相色譜法定性能力較弱，選擇性不強(qiáng)，檢出后還需要質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)。液相色譜-質(zhì)譜法具有分析速度快、選擇性強(qiáng)以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，串聯(lián)質(zhì)譜儀在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下還可以提供化合物二級(jí)碎片離子，因而能夠?qū)衔镞M(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析[9-10]。

試驗(yàn)以常見的幾種減肥類保健食品為研究對(duì)象，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件、液相條件以及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種能夠同時(shí)對(duì)減肥類保健食品中6種典型違禁藥物進(jìn)行快速篩查的試驗(yàn)方法，以滿足目前實(shí)驗(yàn)室多批次、多組分、快速篩查的需要，旨在為中國(guó)食品安全提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料

TSQ Quantis型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（配有ESI源和TraceFinder定量處理軟件，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Hettich 380R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)海蒂詩(shī)公司）；ME204E型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SDC-3000多管渦旋混勻儀（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；SB-800DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；

甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)MERCK公司）。

6種違禁藥物化合物信息與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息見表1。

表1 6種違禁藥物化合物信息及對(duì)照品信息

試驗(yàn)用減肥類保健食品來(lái)自周邊市場(chǎng)抽取以及公安機(jī)關(guān)送檢。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：分別精密稱取5 mg酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中；準(zhǔn)確吸取1.0 mL麻黃堿、芬氟拉明標(biāo)準(zhǔn)品至20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得到各組分濃度為0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備：分別從各組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取1.0 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備：從混合標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別吸取2.0，1.0，0.5，0.2和0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇分別溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為200，100，50，20和10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.2 樣品溶液制備

固體樣品（硬膠囊、片劑等）：樣品預(yù)先均質(zhì)成粉狀，從中精確稱取2.00 g樣品至50 mL容量瓶中，加入1%甲酸-甲醇40 mL，振搖充分，超聲20 min，取出后恢復(fù)至室溫并用1%甲酸-甲醇定容，必要時(shí)可擴(kuò)大稀釋倍數(shù)，清液經(jīng)0.22 μm針頭濾器過(guò)濾后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

液體樣品（口服液、軟膠囊等）：準(zhǔn)確吸取樣品2.0 mL至50 mL容量瓶中，其他處理步驟同固體樣品。

根據(jù)實(shí)際測(cè)樣的經(jīng)驗(yàn)，有些減肥類保健食品中違禁藥物的含量可能達(dá)到藥物級(jí)別，為避免過(guò)高濃度的組分污染質(zhì)譜系統(tǒng)，建議測(cè)定時(shí)先選取較大的稀釋倍數(shù)，后再根據(jù)實(shí)測(cè)值對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行調(diào)整。

1.2.3 液相條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：A/B=0.1%甲酸-水/甲醇；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min，20% B；0.5～4 min，75% B；4～6 min，75% B；6～6.1 min，20% B；6.1～8 min，20% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源類型：電噴霧電離源（ESI）；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；離子源電壓：3 500 V；霧化器溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；6種違禁藥物液相、質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

表2 6種違禁藥物液相、質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

考慮到多數(shù)保健食品基質(zhì)干擾較小以及實(shí)驗(yàn)室快速篩查的需要，重點(diǎn)考察了溶劑提取法的提取效果。溶劑提取法常采用甲醇或乙腈[11]作為提取溶劑，違禁藥物多為堿性化合物，加入適量甲酸有助于提高待測(cè)組分的離子化效率，故分別測(cè)試了甲醇、1%甲酸-甲醇、乙腈、1%甲酸-乙腈四種不同溶劑的提取效果。測(cè)試結(jié)果表明，四種溶劑的提取效果由高到低依次為1%甲酸-甲醇＞1%甲酸-乙腈＞甲醇＞乙腈。因此試驗(yàn)選擇提取效果較好且成本較小的1%甲酸-甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取方法的優(yōu)化

分別測(cè)試了渦旋提取5，10和15 min以及超聲提取10，20和30 min的提取效果，其余試驗(yàn)步驟均按照1.2.2小節(jié)前處理方法重復(fù)測(cè)定兩次，取平均回收率進(jìn)行對(duì)比。測(cè)試結(jié)果表明，采用渦旋提取時(shí)，提取效果隨提取時(shí)間的變化規(guī)律為15 min＞10 min＞5 min；采用超聲波提取時(shí)，提取效果隨提取時(shí)間的變化規(guī)律為30 min≈20 min＞10 min。對(duì)比兩種提取方法，超聲提取20 min時(shí)各組分平均回收率均顯著優(yōu)于渦旋提取15 min，因此試驗(yàn)選擇超聲波提取20 min作為提取方法。

2.2 液相與質(zhì)譜條件優(yōu)化

液相方面：試驗(yàn)測(cè)試了0.1%甲酸/水與甲醇作為流動(dòng)相組合的分離效果，結(jié)果表明，在使用該流動(dòng)相組合時(shí)，各組分響應(yīng)值良好，峰型呈現(xiàn)也較好，且儀器故障率顯著降低。色譜柱選擇適合用于藥物分析的Hypersil GOLD C18色譜柱，流速設(shè)為0.25 mL/min，分析總時(shí)長(zhǎng)僅為8 min，各組分保留時(shí)間在2.188～5.119 min之間，分離效率得到顯著改善。各組分離子色譜圖見圖1。

圖1 6種違禁藥物定量離子的離子色譜圖

質(zhì)譜方面：采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），主要優(yōu)化參數(shù)為各化合物的母離子、子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。優(yōu)化方法：取1 μg/mL的6種違禁藥物混標(biāo)溶液，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式，首先進(jìn)行母離子掃描（Q1 Scan），獲取待測(cè)物的母離子，然后通過(guò)子離子掃描（Q3 Scan）獲取其碎片離子，最后用MRM掃描的方式進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后各組分譜參數(shù)見表2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effects，ME）是指由樣品基質(zhì)所引入，造成目標(biāo)組分信號(hào)增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象[12-13]。試驗(yàn)為評(píng)價(jià)不同類型保健食品基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，分別選取片劑、軟降囊、硬膠囊以及口服液四類保健食品的陰性樣品，按照1.2.2前處理方法制備空白基質(zhì)并配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用甲醇配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的斜率之比，得到各樣品的基質(zhì)效應(yīng)（ME），ME越接近1，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)越弱。四類樣本中6種違禁藥物的平均基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算值（ME）見表3。結(jié)果表明，6種違禁藥的平均基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算值均大于0.9，測(cè)定時(shí)可以采取溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 線性范圍及檢出限、定量限

基于優(yōu)化后的液相、質(zhì)譜條件，采用高效液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法對(duì)6種違禁藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。結(jié)果表明，6種違禁藥物在0.5～100 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。再以3倍基線噪聲（S/N）確定各組分的檢出限（limits of detection，SLOD），10倍基線噪聲（S/N）確定各組分的定量限（limits of quantification，SLOD）。結(jié)果表明，6種違禁藥物在該方法下檢出限為0.5～1.0 μg/kg，定量限為1.4～3.5 μg/kg。結(jié)果詳見表3。

表3 線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

采用1.2.2小節(jié)前處理方法，選取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為低、中、高三個(gè)水平（20，100和500 μg/kg），每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和精密度（Relative standard deviations，SRSD），結(jié)果見表4。加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 μg/kg時(shí)，回收率為78.1%～95.3%，SRSD為3.6%～8.8%；加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 μg/kg時(shí)，回收率為86.1%～97.2%，SRSD為4.4%～7.7%；加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)500 μg/kg時(shí)，回收率為90.7%～99.3%，SRSD為3.7%～8.1%。

表4 6種違禁藥物平均回收率結(jié)果（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

取市售和公安機(jī)關(guān)送檢樣品（共計(jì)50批次），采用1.2.2小節(jié)前處理方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，50批次樣品中合計(jì)檢出含有西布曲明的樣品8批次，檢出率16%，含量差異較大，其中含量最低的為0.25 mg/kg左右，含量最高的則達(dá)到110 g/kg左右，含量超過(guò)臨床用藥劑量的數(shù)倍。其余5種違禁藥物未見檢出。

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、提取方法、液相色譜條件及質(zhì)譜條件，建立了基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)減肥類保健食品中6種違禁藥物快速篩查方法，并對(duì)該方法的線性范圍、加標(biāo)回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限以及定量限進(jìn)行充分驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，后又將該方法應(yīng)用于多種減肥類保健食品的實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程，并檢出含有西布曲明成分的樣品。該試驗(yàn)方法具有操作簡(jiǎn)單、成本較低、分析快速、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠充分滿足檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)減肥類保健食品中違禁藥物快速篩查的需求。