超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中三種農(nóng)藥殘留

劉偉悅

北京張一元金橋茶葉有限公司（北京 101102）

我國(guó)是茶樹(shù)原產(chǎn)地，茶葉生產(chǎn)歷史悠久。茶葉作為一種健康飲品，深受全世界消費(fèi)者的喜愛(ài)。茶葉中不僅富含茶多酚及兒茶素，還含有鉀、鈣、鎂、錳等多種礦物質(zhì)。茶葉也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和出口農(nóng)產(chǎn)品。作為我國(guó)茶葉的重要進(jìn)口國(guó)，歐洲和日本制定了極為嚴(yán)苛的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟標(biāo)準(zhǔn)和日本肯定列表中關(guān)于茶葉的農(nóng)殘項(xiàng)目分別為480種[1-2]和276種，農(nóng)殘限量在0.01～30.0 mg/kg之間，國(guó)際食品法典委員會(huì)農(nóng)殘限量（CAC）在0.01～50.0 mg/kg之間，對(duì)于沒(méi)有明確規(guī)定農(nóng)藥殘留限量的農(nóng)藥一律采用不得大于0.01 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國(guó)最新版國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]中涉及茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量已經(jīng)達(dá)到106種，農(nóng)藥殘留限量在0.01～50.0 mg/kg之間，對(duì)未涉及農(nóng)藥殘留限量的農(nóng)藥沒(méi)有具體規(guī)定。

為了提高茶葉產(chǎn)量，農(nóng)藥在茶葉病蟲(chóng)防治中得到了廣泛使用，敵敵畏、樂(lè)果和喹硫磷均為有機(jī)磷類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于茶葉中的殺蟲(chóng)、殺螨劑，由此帶來(lái)的農(nóng)藥殘留可能危害消費(fèi)者健康。隨著生活水平日益提高，人們對(duì)茶葉的質(zhì)量和安全性都有了更高的要求[4]。農(nóng)藥殘留分析作為一項(xiàng)對(duì)復(fù)雜混合物中痕量組分的分析技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-6]。其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法利用被測(cè)樣品離子質(zhì)荷比，定性定量更加準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度更高，對(duì)于茶葉類復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留檢測(cè)有其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

研究建立了適用于檢測(cè)茶葉中農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法簡(jiǎn)單快速、分離度好、重現(xiàn)性好、精密度高，可滿足同時(shí)檢測(cè)茶葉中敵敵畏、樂(lè)果和喹硫磷3種農(nóng)藥殘留的要求[7-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙酮中敵敵畏、樂(lè)果、喹硫磷質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；乙腈、丙酮、甲醇、甲苯、甲酸[色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；純凈水（杭州娃哈哈有限公司）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，北京化工廠），經(jīng)550 ℃灼燒4 h，儲(chǔ)存于干燥器中，冷卻后備用；Cleanert TPT固相萃取柱（Agela公司）；0.22 μm尼龍微孔過(guò)濾膜（津騰公司）。

UPLC/TSQ Quantum U1tra超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur工作站軟件，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；Hypersil GOLD C8色譜柱[100 mm×2.1 mm，1.9 μm，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；QL-901渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；XHF-DY高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KH-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SE202F電子分析天平（奧豪斯）；TDL-40B臺(tái)式低速離心機(jī)（飛鴿牌）；HY-5A型回旋式振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 待測(cè)液制備

稱取粉碎均勻的試樣5 g（精確至0.01 g），用20.0 mL的乙腈振蕩提取1 h，在4 000 r/min下離心5 min。取4 mL上清液，過(guò)Cleanert TPT固相萃取柱（萃取柱中加入約2 cm高無(wú)水硫酸鈉，用10 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫液預(yù)洗，棄去流出液）凈化，用20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫，收集洗脫液，40 ℃條件下水浴，旋蒸至近干，乙腈+水（3+2，V/V）定容1 mL，過(guò)0.22 μm微孔過(guò)濾膜，混勻，待UPLC-MS/MS測(cè)定，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線定量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：將1 000 μg/mL丙酮中敵敵畏、樂(lè)果、喹硫磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-20 ℃保存。分別吸取樂(lè)果和喹硫磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL加入10.0 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A，同樣方法得到1 μg/mL的敵敵畏、樂(lè)果、喹硫磷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B，于-20 ℃保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：同1.2.1小節(jié)待測(cè)液制備的方法，用未檢出待測(cè)農(nóng)藥的綠茶樣品制作基質(zhì)空白溶液，分取16 mL上清液過(guò)柱，20 mL乙腈+甲苯（3+1）洗脫，用乙腈+水（3+2）定容至8 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，所得溶液為基質(zhì)空白溶液。準(zhǔn)確配制基質(zhì)空白中3種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200，400和600 μg/L進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件

Hypersil GOLD C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。流動(dòng)相組成：流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1；色譜柱溫度40oC，進(jìn)樣量為5 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

電離方式ESI+；噴霧電壓：3 200 V；離子傳輸管溫度：320 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；鞘氣：氮?dú)猓髁?30 L/h；輔助氣：氮?dú)猓髁?80 L/h；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓力1.5 mTorr；氮?dú)夂蜌鍤饧兌染笥?9.999%；選擇離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描（SRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化好的色譜條件下，采用全掃描Full Scan方式對(duì)單一標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μg/mL進(jìn)樣，獲得化合物的特征離子，選擇離子豐度最高的[M+H]+m/z作為母離子；然后進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，找到特征離子及其最佳CE。試驗(yàn)選擇每種化合物豐度較高的兩個(gè)離子分別作為定量離子和定性離子。化合物英文名稱、保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2.2 提取過(guò)程的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

在農(nóng)藥殘留提取的過(guò)程中，根據(jù)農(nóng)藥的極性、性質(zhì)等因素選擇合適的提取溶劑。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)的過(guò)程中，常見(jiàn)的提取溶劑有乙腈、丙酮、甲醇、正己烷、石油醚等，研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗(yàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用乙腈、丙酮和甲醇3種有機(jī)溶劑作為提取溶劑分別做3平行試驗(yàn)，回收率見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，甲醇作為提取劑時(shí)樂(lè)果和喹硫磷回收率極低，敵敵畏回收率為零。由于甲醇的溶解性較好，在提取的過(guò)程中，提取液比較渾濁，最后定容，待上機(jī)的溶液會(huì)分層，這可能是導(dǎo)致三種農(nóng)殘回收率都很低的原因。乙腈和丙酮提取的回收率比較接近，但是乙腈對(duì)于色素和油脂的提取能力不強(qiáng)，因此可以減小雜質(zhì)的干擾，提取的回收率整體更優(yōu)于丙酮，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 三種提取溶劑農(nóng)殘回收率對(duì)比（n=3）

2.2.2 提取方式的優(yōu)化

研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗(yàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用超聲、振蕩和均質(zhì)三種方式提取，分別做3組平行試驗(yàn)，回收率見(jiàn)圖2。

圖2 三種提取方式農(nóng)殘回收率對(duì)比（n=3）

從圖2可以看出，超聲提取方式對(duì)樂(lè)果的回收率相對(duì)較低，均質(zhì)提取方式對(duì)喹硫磷的回收率相對(duì)較高，這可能是超聲和均質(zhì)提取方式使一部分干擾物被提取出來(lái)，增強(qiáng)了茶葉的基質(zhì)干擾。而通過(guò)振蕩提取的方式，三種農(nóng)藥的回收率表現(xiàn)良好。因此，試驗(yàn)選擇振蕩提取。

2.2.3 洗脫液提體積的優(yōu)化

研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗(yàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用乙腈+甲苯（3+1，V/V）作洗脫液，Cleanert TPT固相萃取柱進(jìn)行凈化，洗脫液體積分別為10，15，20，25和30 mL，分別做3組平行試驗(yàn)，回收率見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，喹硫磷的回收率受洗脫液體積影響較小。對(duì)于樂(lè)果和敵敵畏，隨著洗脫液體積的增加，其平均回收率總體呈上升趨勢(shì)；但超過(guò)20 mL之后，隨著洗脫液體積的增加，其回收率變化不明顯。基于添加回收率要求和試驗(yàn)操作的實(shí)際需求，選擇20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）作為洗脫液。

圖3 洗脫液體積對(duì)農(nóng)殘回收率的影響（n=3）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

按上述方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以目標(biāo)組分的響應(yīng)面積（y）和對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在10～600 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以10倍信噪比（S/N）計(jì)算方法的定量限[14-20]，茶葉中三種農(nóng)藥線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和限值見(jiàn)表3。

表3 茶葉中3種農(nóng)藥線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和限值

2.4 加標(biāo)回收和精密度

選擇空白樣品進(jìn)行加標(biāo)處理，處理方法同待測(cè)液的制備方法。按照所建立的方法處理、測(cè)定，加標(biāo)水平為0.01，0.02，0.1和0.4 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)量重復(fù)6次，驗(yàn)證方法的精密度。空白樣品中3種農(nóng)藥加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，3種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在68.7%～114.9%之間，精密度為2.7%～10.8%。回收率和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表4 農(nóng)藥加標(biāo)回收率及精密度

2.5 5種茶葉樣品加標(biāo)回收率分析

對(duì)綠茶、紅茶、茉莉花茶、大紅袍和普洱生茶5種茶葉進(jìn)行3種農(nóng)殘加標(biāo)試驗(yàn)。制備均勻樣品，采用此方法提取、凈化、上機(jī)測(cè)試，添加水平及回收率見(jiàn)表5。從表5中可以看出，5種茶葉中3種農(nóng)藥的回收率在66.6%～113.6%之間，表明此方法可用于茶葉中3種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。

表5 5種茶葉加標(biāo)回收

2.6 樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取綠茶、紅茶、黑茶、烏龍茶、白茶、茉莉花茶等六種茶樣，共198批次，采用上述建立的檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，敵敵畏、樂(lè)果和喹硫磷均未被檢出。

3 結(jié)論

用乙腈振蕩提取1 h，Cleanert TPT固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，建立了茶葉中同時(shí)測(cè)定樂(lè)果、敵敵畏和喹硫磷殘留量的測(cè)定方法，且方法線性相關(guān)性好、簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高，在回收率、定量限和精密度等方面均能滿足我國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家對(duì)于茶葉中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)要求。研究一方面可為茶葉產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的完善提供數(shù)據(jù)，另一方面可為監(jiān)管部門(mén)對(duì)茶葉產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供方法參考。