胃癌中TRIM11的表達及其對PI3K/Akt信號通路的影響

都向陽，袁 偉，任 磊，侯英勇

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，具有發病率、病死率高的特點[1-2]。流行病學調查顯示：2015年我國新發胃癌患者40萬，死亡患者約29萬，嚴重危害人類生命健康[3]。目前有關胃癌的治療方式主要包括手術和放、化療，其中手術治療仍然是胃癌患者獲得良好預后的關鍵，然而胃癌的發病機制較為復雜，病死率仍較高[4-5]。

三結構域蛋白11(tripartite motif containing 11, TRIM11)是TRIM家族蛋白成員之一，廣泛參與細胞凋亡、增殖，對細胞周期調控起重要作用[6]。TRIM11作為一種促癌因子，可以通過多途徑促進腫瘤細胞增殖和侵襲[7]。在分期較高的膠質瘤中TRIM11呈高表達，低分化以及預后良好的膠質瘤中TRIM11呈低表達[8]。另外，TRIM11能夠通過激活MAPK信號或PI3K/Akt信號促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[9-10]。目前，有關TRIM11在胃癌中的表達及其對胃癌細胞增殖和凋亡等生物學功能及其潛在的分子機制尚不清楚。因此，本文擬通過分析胃癌組織中TRIM11的表達及其與胃癌臨床病理特征的相關性，并進一步通過體外細胞實驗探討TRIM11對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及其潛在分子作用機制，以期為胃癌患者提供新的診斷標志物和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2018年1月～2021年1月復旦大學附屬中山醫院行手術腫瘤切除治療，且隨訪資料和病理資料均完整的胃癌標本120例。胃癌癌組織及其癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣3 cm以上)樣本經手術切除后迅速分塊放置于液氮罐內凍存或經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋保存。患者病理信息由我院病理醫師復診確診。

1.1.2主要試劑 免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；qTR-PCR檢測試劑盒(日本Takara公司)；引物設計與合成(上海生工生物工程公司)；轉染試劑盒(廣州銳博公司)；TRIM11兔單克隆抗體、PI3K小鼠多克隆抗體、Akt兔多克隆抗體(英國Abcam公司)；HRP標記山羊抗兔二抗、HRP標記山羊抗小鼠二抗、EdU細胞增殖檢測試劑盒、BCA試劑盒、ECL顯影液(碧云天公司)。

1.1.3儀器 細胞勻漿儀(武漢泰普拓公司，型號TWK-FST32)；高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技中國公司，型號Micro17R)；倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司，型號GPJ9-TS100-F)；全自動多功能酶標檢測儀(賽默飛世爾科技中國公司，型號FC)；電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司，型號1658033)；ChemiDoc XRS+成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化檢測TRIM11表達 石蠟樣本4 μm厚切片，按照免疫組化EnVision法染色試劑盒進行操作。3%H2O2孵育10 min消除內源性過氧化物酶，85 ℃抗原修復，加入10%BSA封閉20 min。加入TRIM11小鼠單克隆抗體(稀釋比1∶200)，4 ℃孵育過夜。加入對應HRP標記的山羊抗小鼠二抗，室溫下孵育30 min。滴加DAB顯色液顯色，其中TRIM11陽性區域存在明顯的棕色顆粒沉著。免疫組化結果判定：細胞膜無陽性著色或著色<10%為陰性；細胞膜著色≥10%為陽性。

1.2.2細胞培養與轉染 人胃黏膜上皮細胞GES-1購于北京腫瘤研究所，人胃癌細胞株AGS、HGC-27、BGC-82購自ATCC公司，將含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱內培養。當AGS細胞生長融合度達60%～70%時，使用質粒3000轉染試劑盒分別轉染TRIM11無關片段(TRIM11-NC組)以及TRIM11干擾片段(TRIM11-siRNA組)。依據轉染試劑盒說明書進行相關操作，其中TRIM11-NC序列：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGU-3′；TRIM11-siRNA序列：5′-GCG UGCAAGUGGACGUUAATT-3′。Control組細胞常規(含10%FBS的DMEM培養基)培養24 h。

1.2.3qRT-PCR檢測TRIM11 mRNA表達水平 取液氮罐內凍存的胃癌組織樣本，經液氮研磨后，加入TRIzol裂解液提取組織樣本總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行TRIM11 mRNA表達擴增，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算得出TRIM11 mRNA的相對表達量。TRIM11引物序列：上游5′-TGCCAGCTGCTTAAA CATTC-3′，下游5′-GTGGCTGAGCTCTTCTGTCG-3′。β-actin引物序列：上游5′-CCATCACCATCTTCCAG GAG-3′，下游5′-CCTGCTCACCACCTTCTTG-3′。以胃癌組織TRIM11 mRNA表達平均值為界，將TRIM11 mRNA表達分為高表達組和低表達組。

1.2.4EdU染色檢測胃癌細胞增殖 取對數生長期胃癌細胞，按照(0.4～1)×104個/孔接種至96孔板內，培養至正常生長階段。(1)EdU標記：細胞培養基∶EdU溶液按照1 000∶1的比例制備EdU稀釋液；(2)每孔加入100 μL EdU培養液孵育2 h，傾去培養基；(3)PBS浸洗細胞1～2次，每次3 min；(4)每孔加入100 μL細胞固定液，室溫固定20 min；(5)PBS浸洗細胞1～2次，每次3 min；(6)每孔加入100 μL DAPI染液，避光、室溫、脫色搖床孵育約20 min，傾去細胞染液；(7)每孔每次加入100 μL PBS浸洗1～3次，于100倍顯微鏡下觀察著色情況并拍照。胃癌細胞增殖指數(%)=EdU陽性細胞數/細胞核總數×100%。

1.2.5流式細胞術檢測胃癌細胞凋亡 細胞轉染TRIM11-NC或TRIM11-siRNA 24 h后，收集各組細胞，PBS浸洗3次，離心后傾去細胞液，細胞重懸將濃度調整為1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，在488 nm處分別激發525 nm和620 nm帶孔濾波器，檢測FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)熒光，從而得到三組胃癌細胞的凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測TRIM11、PI3K、Akt的表達 收集各組細胞；4 ℃條件下裂解30 min，期間每隔5 min震蕩1次；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入TRIM11小鼠單克隆抗體(1∶1 000)，PI3K小鼠多克隆抗體(1∶1 000)，Akt兔多克隆抗體(1∶1 000)以及β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，加入對應HRP標記的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗((1∶5 000)孵育1～2 h；搖床上搖晃，TPBS洗滌5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照。

2 結果

2.1 胃癌組織中TRIM11蛋白表達水平癌旁正常胃黏膜組織中TRIM11陽性率11.7%(14/120)，胃癌癌組織中TRIM11陽性率為80.8%(97/120)，TRIM11表達顯著高于癌旁組織(P<0.01，圖1)。

圖1 胃組織中TRIM11蛋白表達水平，EnVision法：A.癌旁組織；B.癌組織

2.2 胃癌組織中TRIM11 mRNA表達及與臨床病理特征的關系胃癌組織中TRIM11 mRNA高表達68例，低表達52例。胃癌組織中TRIM11 mRNA表達與臨床分期、淋巴結轉移及浸潤深度均有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、遠處轉移及分化程度均無關(P>0.05，表1)。

表1 TRIM11 mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 胃癌細胞中TRIM11 mRNA表達水平與正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，胃癌細胞系HGC-27、BGC-823和AGS中TRIM11 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05，圖2)。其中AGS中TRIM11 mRNA表達水平最高，應用該細胞株進行后續實驗。

圖2 正常胃黏膜上皮細胞及胃癌細胞中TRIM11 mRNA表達：與正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 轉染TRIM11-siRNA對胃癌細胞增殖的影響轉染TRIM11-siRNA后，Western blot檢測TRIM11蛋白表達水平結果顯示：與Control組相比，TRIM11-siRNA組細胞TRIM11蛋白表達顯著降低(P<0.01)，TRIM11-NC組無顯著變化(P>0.05，圖3)。EdU檢測顯示：與Control組相比，轉染TRIM11-siRNA組細胞增殖顯著降低(P<0.01)，轉染TRIM11-NC組細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05，圖4)。

圖3 Western blot檢測TRIM11蛋白表達水平：與Control組相比，**P<0.01

圖4 EdU檢測胃癌細胞增殖情況：與Control組相比，**P<0.01

2.5 轉染TRIM11-siRNA對胃癌細胞凋亡的影響流式細胞術檢測顯示：與Control組相比，轉染TRIM11-siRNA組細胞凋亡指數顯著升高(P<0.01)，轉染TRIM11-NC組細胞凋亡指數差異無統計學意義(P>0.05，圖5)。

圖5 流式細胞術檢測胃癌細胞凋亡情況：與Control組相比，**P<0.01

2.6 轉染TRIM11-siRNA對胃癌細胞PI3K/Akt信號的影響Western blot檢測顯示：與Control組相比，轉染TRIM11-siRNA組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.01)，轉染TRIM11-NC組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達量無顯著變化(P>0.05，圖6)。

圖6 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達：與Control組相比，**P<0.01

3 討論

TRIM11作為TRIM基因家族成員之一，其在多種疾病中的作用日益受到重視。TRIM11不僅可維持機體的正常生理狀態(如細胞生長、細胞分化以及細胞凋亡等)，而且還參與了多種疾病的發生發展，如腫瘤和神經系統疾病等[11-12]。新近研究發現，TRIM11能夠調控腫瘤細胞的增殖和凋亡，進而影響腫瘤的進程[13]。然而，目前有關TRIM11在胃癌發生、發展中的機制尚不清楚。

既往研究證實，TRIM11可通過激活MAPK信號通路，促進骨肉瘤細胞增殖，延長細胞周期[10]。另外，在肝癌組織中TRIM11表達顯著升高，且TRIM11表達水平與肝癌患者疾病進展及預后呈負相關，提示TRIM11可能是肝癌患者治療的潛在靶點[14]。本研究首先通過免疫組化檢測TRIM11在120例手術切除胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，結果顯示與癌旁正常組織相比，胃癌組織中TRIM11陽性細胞比例顯著升高，表明TRIM11表達與胃癌疾病進展可能存在一定的相關性。本組檢測TRIM11 mRNA表達并對其與臨床病理特征的關系進行分析，結果顯示TRIM11 mRNA表達與胃癌臨床分期、淋巴結轉移以及浸潤深度均有相關性，而與患者年齡、性別、遠處轉移及分化程度均無關，提示TRIM11可能是胃癌疾病發生、發展的潛在靶標分子。細胞增殖和凋亡的失衡是腫瘤細胞惡性生長和病變關鍵環節[15]。既往研究顯示敲低TRIM11能夠抑制結直腸癌細胞HT29增殖，促進凋亡[16]。因此，本研究進一步通過體外細胞實驗探討TRIM11對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，結果顯示與正常胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞系TRIM11 mRNA表達水平顯著升高，與文獻報道一致。與Control組相比，TRIM11-siRNA組細胞TRIM11蛋白表達顯著降低，表明胃癌細胞轉染TRIM11-siRNA成功。EdU和流式細胞術檢測顯示：與Control組相比，轉染TRIM11-siRNA組細胞增殖指數顯著降低，凋亡指數顯著升高，表明TRIM11能夠促進胃癌細胞增殖，抑制凋亡。PI3K/Akt信號轉導在在胃癌細胞增殖和凋亡中發揮重要作用[17]。研究顯示激活PI3K/Akt信號轉導能夠促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡[18]。另外，PI3K/Akt信號通路的激活促進MMP-2表達增加，活性增強，從而介導細胞外基底膜膠原降解，并最終促進胃癌細胞向外周圍浸潤，促進細胞侵襲和轉移[19]。因此，針對PI3K/Akt信號通路靶向治療越來越受到研究者的關注。本研究通過Western blot檢測顯示：與Control組相比，轉染TRIM11-siRNA組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量均顯著降低，表明TRIM11能夠通過激活PI3K/Akt信號傳導，促進胃癌細胞增殖，抑制凋亡。

綜上，胃癌組織中TRIM11呈高表達，且其與胃癌的惡性病理因素相關，TRIM11能夠通過PI3K/Akt信號促進胃癌細胞增殖，抑制細胞凋亡。本研究仍存在一定不足，實驗僅從細胞層面上初步揭示了TRIM11對胃癌增殖和凋亡的影響和機制，未在動物實驗進一步驗證。為此在后續的研究中將通過構建胃癌細胞株裸鼠皮下移植瘤模型，明確TRIMM11對移植瘤生長作用，為胃癌診斷和治療提供可靠的實驗依據。