膀胱尿路上皮癌中LRG1和TGF-β1的表達及臨床病理意義

陳 龍，張 倩，徐春明，蔡菁菁，張紅霞，劉雨清，孫永紅，丁小娣

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)是指發生于膀胱黏膜的惡性腫瘤，2020年WHO國際癌癥研究機構(IARC)最新數據顯示BUC是全球十大常見癌癥之一[1]。富亮氨酸α2糖蛋白1(leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1)是一種新發現的癌基因相關蛋白，在舌癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[4]和白血病[5]等惡性腫瘤中表達上調。另外，非肌層浸潤性膀胱癌患者尿液中LRG1蛋白含量增多[6]。轉化生長因子beta 1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)是膀胱癌中的重要分子靶標[7]，GP73可激活TGF-β1/Smad2信號通路，并通過下調WT-1表達誘導膀胱癌上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，從而促進膀胱癌的侵襲和轉移[8]。研究表明LRG1可通過直接結合TGF-β1輔助受體Endoglin激活Smad1/5/8來加速血管生成[9]。目前，LRG1在BUC中表達及與BUC臨床病理特征和TGF-β1的關系尚不明確。本文主要探討LRG1、TGF-β1在BUC中的表達，并分析兩者表達間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年6月～2021年6月濰坊醫學院附屬醫院診治的64例BUC，患者年齡31～87歲，男性39例，女性25例，平均(64.75±13.20)歲，≥60歲42例，<60歲22例。所有標本組織學分型參照WHO(2016)泌尿及男性生殖系統腫瘤分類標準。低級別BUC 33例，高級別BUC 31例；非肌層浸潤性BUC 41例，肌層浸潤性BUC 23例。同時收集25例癌旁組織標本作為對照組。本實驗經濰坊醫學院附屬醫院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技公司；免疫組化小鼠/兔SP試劑盒與DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)購自北京中杉金橋公司；兔抗LRG1購自美國Proteintech公司；鼠抗TGF-β1(2Ar2)購自英國Abcam公司。

1.3 HE及免疫組化石蠟組織連續4 μm厚切片，脫蠟入水，HE染色依次用蘇木精染色2 min，分化30 s后沖洗，伊紅染色15 s后沖洗，脫水、透明、封固。免疫組化切片脫蠟入水后，依次用新鮮配置的0.3%H2O2阻斷劑37 ℃孵育30 min，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復10 min，正常山羊血清37 ℃封閉30 min，滴加一抗工作液TGF-β1(1∶100)、LRG1(1∶250)，室溫孵育30 min，4 ℃孵育過夜。次日，依次滴加生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物及辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，分別室溫孵育30 min，PBS洗滌后加入新鮮配置的DAB染液，避光室溫孵育5 min，自來水洗滌，蘇木精染色2 min，分化后返藍，脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 結果判定LRG1、TGF-β1均表達于細胞質，陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，采用半定量法分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評分。(1)按陽性細胞百分比進行評分：每張切片觀察5個高倍視野(×200)，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。(2)按陽性著色強度進行評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強陽性()。

1.5 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗分析LRG1和TGF-β1在BUC組織與癌旁組織中的表達差異及兩者與臨床病理特征的關系；相關性分析采用雙變量線性回歸相關分析；采用多因素方差分析進一步探究相關危險因素的影響，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BUC中LRG1表達及其與臨床病理特征的關系相比癌旁組織和低級別非浸潤性BUC，高級別浸潤性BUC的腫瘤細胞浸潤至基膜下，細胞異型更明顯(圖1A～C)。LRG1在癌旁組織和BUC組織中主要定位于腫瘤細胞胞質(圖1D～F)，LRG1在64例BUC組織中有27例(42.19%)強陽性，在癌旁組織中僅2例(8.00%)強陽性，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。經統計學分析顯示，高級別浸潤性BUC中LRG1的表達水平高于低級別浸潤性BUC(P<0.05)，并與腫瘤浸潤深度相關(P<0.05)，Ki-67增殖指數≥30%組的LRG1表達高于Ki-67增殖指數<30%組(P<0.05)；長期吸煙、有膀胱慢性炎癥患者的LRG1表達水平較不吸煙者、無慢性炎癥者高。不同年齡、性別組BUC組織中LRG1的表達，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2 TGF-β1表達及其與BUC臨床病理特征的關系 TGF-β1在BUC組織中陰性15例(23.44%)，陽性49例(76.56%)；在癌旁組織中陰性15例(60%)，陽性10例(40%)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05，圖1G～I)。經統計學分析顯示，在高級別浸潤性BUC中TGF-β1的表達水平高于低級別BUC(P<0.05)，且與腫瘤浸潤深度相關(P<0.05)；Ki-67高增殖指數組中TGF-β1表達明顯高于低增殖指數組(P<0.05)；長期吸煙、患有膀胱慢性炎癥的患者TGF-β1表達水平與不吸煙者、無慢性炎癥者相比無明顯升高(P>0.05)。不同年齡、不同性別BUC組織中TGF-β1表達差異均無統計學意義(P均>0.05，表1)。

圖1 A.癌旁組織HE染色；B.低級別非浸潤性BUC HE染色；C.高級別浸潤性BUC HE染色；D.癌旁組織中LRG1呈陰性，SP法；E.低級別非浸潤性BUC中LRG1弱陽性，SP法；F.高級別浸潤性BUC中LRG1呈強陽性，SP法；G.癌旁組織中TGF-β1呈陰性，SP法；H.低級別非浸潤性BUC中TGF-β1呈弱陽性，SP法；I.高級別浸性潤BUC中TGF-β1呈強陽性，SP法

表1 膀胱尿路上皮癌組織中LRG1和TGF-β1表達與臨床病理特征的關系

2.3 LRG1、TGF-β1蛋白表達的相關性雙變量線性回歸相關分析顯示BUC組織中LRG1和TGF-β1蛋白表達呈正相關(r2=0.658 2，P<0.05，圖2A)；LRG1和TGF-β1表達均與Ki-67增殖指數呈正相關(r2=0.281 2，r2=0.364 3，P均<0.05，圖2B、C)。

圖2 A.LRG1與TGF-β1蛋白表達的相關性；B.LRG1表達與Ki-67增殖指數的相關性；C.TGF-β1表達與Ki-67增殖指數的相關性

2.4 多因素分析LRG1、TGF-β1表達的影響因素多因素方差分析顯示：病理學分級、浸潤深度以及慢性炎癥對LRG1的表達均有明顯影響(P均<0.05，表2)。

表2 多因素方差分析

多因素方差分析顯示：病理學分級、浸潤程度對TGF-β1表達有明顯影響(P均<0.05)，而吸煙及慢性炎癥的影響無統計學意義(P均>0.05)，這與單因素分析結果相一致。

3 討論

膀胱癌作為泌尿系統常見的惡性腫瘤，男性的發病率和病死率約為女性的4倍[1]。我國膀胱癌的發病率呈逐年上升趨勢，由于膀胱癌的生物學行為的異質性及不可預測性，臨床診治較為棘手。因此，亟需尋找新的靶點突破這一窘境。

LRG1為富亮氨酸重復序列蛋白家族的高度保守成員之一，在多種腫瘤的發生、侵襲轉移、EMT和血管生成中發揮重要作用，可作多種惡性腫瘤診斷的生物學標志物，且與不良預后相關。如結直腸癌中LRG1表達明顯增高，并且與腫瘤進展有關[10]；非小細胞肺癌患者的肺組織中LRG1表達增高[11]；肝癌組織中LRG1表達升高，并且是預后不良的獨立危險因素[12]；另外，LRG1還可通過調節EGFR/p38信號促進胰腺癌的生長、轉移[13]。本組結果表明，LRG1在BUC中的表達顯著高于對照組，這與Linden等[6]膀胱癌患者尿液中LRG1蛋白增多的研究結果一致，并且通過深化研究內容可以證實在浸潤性尿路上皮細胞癌中LRG1呈強陽性，與對照組及非浸潤性尿路上皮癌相比差異有統計學意義。Ki-67增殖指數較高的腫瘤中LRG1表達高于Ki-67增殖指數較低者，提示LRG1表達與尿路上皮癌的進展有關。本實驗結果還顯示，BUC患者中吸煙或患有慢性炎癥患者的LRG1表達也相應增高。值得注意的是，吸煙在多因素分析與單因素分析結果不一致，事實上雖然吸煙人群中男性居多，女性吸煙較少，但不能保證女性患者沒有長期暴露于吸煙環境下，這可能是結果出現偏差的原因。

TGF-β1是一種有多重生物學效應的細胞因子，與多種癌癥相關，TGF-β1可在早期肺腺癌中隨組織病理學分級升高而異常升高[14]；TGF-β1可作為CXCR4介導造血干細胞向成纖維細胞分化促進結直腸癌轉移的標志[15]；腫瘤相關成纖維細胞則可以通過TGF-β1信號通路調節前列腺癌的增殖和遷移[16]；胰腺星狀細胞分泌的TGF-β1有調節促進胰腺癌細胞腫瘤特性和干細胞特性的作用[17]。大量研究表明，TGF-β1與LRG1表達之間存在密切聯系。LRG1過表達可激活TGF-β1信號通路，調節膠質瘤細胞系的遷移和侵襲[18]；LRG1在透明細胞腎細胞癌中過表達，可通過TGF-β1信號通路加速其進展[19]；LRG1在膽管癌中通過IL-6/TGF-β1軸影響術后患者的預后[20]。本實驗結果表明TGF-β1在BUC中表達增多，尤其在高級別浸潤性類型中表達明顯；且LRG1與TGF-β1表達呈正相關。這表明LRG1可能通過調節TGF-β1信號通路影響膀胱癌的發生、發展進程，兩者之間可能存在上下游調控關系。

綜上所述，BUC中LRG1表達明顯升高，特別是在高級別浸潤性類型中，提示LRG1可作為BUC的診斷指標。由于本實驗并未對其表達與預后的相關性進行分析，因此我們后續將開展此方面的研究，同時深入探討LRG1與TGF-β1的調控關系。