基于網絡藥理學探討益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的作用機制

丁偉逸 張霆 林越 嚴寅杰

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫骨傷科 上海 200032）

隨著社會現代化的發展，高能量骨折損傷的發生率日益增多，有5%～10%的患者骨折后因損傷嚴重或感染等局部因素，或因吸煙、飲酒、代謝性疾病、手術方式等因素而導致骨延遲愈合，甚至不愈合[1～3]，使患者失去勞動力的同時，對其心理、生理帶來極大負擔[4]。

骨延遲愈合屬于中醫學“腎虛骨萎”范疇，是肢體損傷后，機體臟腑失和，氣血不足，脾胃虛弱，從而使得機體對水谷精微的吸收產生影響，腎氣虧虛造成骨折愈合延遲[5]。該病病機與肝脾腎三臟的虧虛以及腎精的不足有著密切的相關性。肝在體為筋，脾主運化，腎主藏精，主骨、生髓，腎中精氣的盛衰強弱，會直接影響骨骼的生長、營養、功能、愈合等各個方面。骨折長期不愈合，會導致身體元氣漸耗，腎中精氣虧虛，氣的生成不足，氣機升降失常，從而導致病位血運代謝失常，使得局部氣血紊亂，血不得行而致瘀，同時血瘀反過來會進一步影響氣的生成與運行，因此“氣虛、血瘀、腎虧”是骨延遲愈合的基本病理基礎。上海中醫藥大學終身教授施杞先生根據多年治療骨延遲愈合的臨床經驗，結合石氏傷科理論，創立施氏熱痹方，旨在益氣活血、清熱利濕，取得了良好的臨床療效[6]。因此，深入揭示益氣化瘀補腎方的藥物生效機制將為其在臨床上的推廣應用提供強大的理論支撐。

網絡藥理學是具有整體性與系統性的一門學科，這兩個特點契合中醫藥的辨證論治、整體觀等基本理論，可以很好闡述中醫藥的物質基礎與作用機制[7]。本研究通過網絡藥理學方法探討益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的主要有效化合物、作用靶點、作用通路，從而為骨延遲愈合的治療提供可行的思路?，F報道如下：

1 工具與方法

1.1 藥物中活性成分及作用靶點的篩選 在TCMSP （Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology） 數 據 庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索本復方中藥物所含有的化學成分，并對候選化學成分進行篩選，條件為類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%，其中收錄有當歸、川芎、桃紅、紅花、黃芪、丹參、肉蓯蓉、黨參、淫羊藿、蒼術、赤芍。但生地黃、補骨脂成分未收錄其中，因此再次將兩味中藥所含化學成分，通過TCMID 數據庫檢索，并添補方中所含其他中藥的化學成分。將得到的化學成分再次基于TCMSP 數據庫進行檢索，以DL≥0.18、OB≥30%為條件，此條件與之前相同，將有效成分篩選出來后，整合以上操作所檢索出的所有藥物數據，獲得本方中所含有的化合物。將復方化合物的潛在靶點用TCMSP 平臺檢索，將靶點蛋白名稱基于String 數據庫（https://string-db.org）檢索，設定物種為人（homosapiens），將非人類的所有靶點排除，并取得蛋白的Gene Symbol。

1.2 疾病相關靶點的收集 將關鍵詞delay fracture union 相關靶點使用OMIM 數據庫（https://omim.org/）、Genecards 數 據 庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索。

1.3 藥物-靶點網絡的構建與分析 在Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org/）中通過交集疾病靶點和藥物靶點，從而構建藥物-靶點-疾病網絡，使用Network Analyzer 工具進行拓撲學分析。

1.4 靶點蛋白交互作用網絡的構建 具有高置信度的交集靶點蛋白交互作用信息通過String 數據庫取得，將這些交集靶點蛋白的信息使用Cytoscape軟件構建交互作用網絡（Protein Protein Interaction Network,PPI Network），并采用Network Analyzer 工具來進行拓撲學分析。

1.5 靶點的生物功能富集分析 采用Bioconductor（www.bioconductor.org/） 中 的R 包（https://www.r-project.org/）cluster profile version 3.12.0 進 行KEGG 通路富集分析（KEGG Pathway Analysis）和GO（Gene Ontology）功能富集分析，分析對象為潛在作用靶點，設定閾值P＜0.05，選擇的通路與骨延遲愈合相關，在Cytoscape 軟件中構建靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 益氣化瘀補腎方的活性成分以及藥物-潛在靶點網絡 以TCMID 和TCMSP 平臺篩選益氣化瘀補腎方中藥活性成分，黃芪20 個活性化合物、黨參21 個、肉蓯蓉6 個、蒼術9 個、丹參65 個、當歸2個、紅花22 個、川芎7 個、桃仁22 個、淫羊藿23 個、赤芍29 個，生地黃4 個、補骨脂3 個，去除重復后，活性成分共篩選出154 種，共251 個藥物靶點。共909 個“delay fracture union”相關靶點，以及84 個藥物和疾病的交集靶點基于OMIM 數據庫、GeneCards 數據庫篩選出來。通過Cytoscape 軟件所構建的藥物-靶點-疾病網絡，共有144 個節點和835 條邊在此網絡中。見圖1。拓撲學分析結果表明，網絡度值（Degree）中位數2 倍值為4，緊密中心性（Closeness Centrality,CC）中位數為0.387 722 13，介度中心性（Betweenness Centrality, BC） 中位數為0.001 202 195，活性成分中滿足上述拓撲學參數的有Kaempfero（山柰酚）、Luteolin（毛地黃黃酮）、Baicalein （黃芩甙元）、Wogonin （漢黃芩素）、Quercetin（槲皮素）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）和ellagic acid（鞣花酸）等56 種活性成分，這些分子能在4 個以上的交集靶點發生效應，其效應可能對治療作用影響較重要，因此核心活性成分選取以上活性成分。上述活性成分信息見表1。

圖1 益氣化瘀補腎方藥物-潛在靶點網絡

表1 益氣化瘀補腎方核心活性成分拓撲學參數信息

續表

2.2 靶點蛋白PPI 網絡 基于String 數據庫和Cytoscape 軟件構建高置信度交集靶點蛋白PPI 網絡，節點的顏色和直徑與此節點Degree 值成正相關，顏色越深，直徑越大，Degree 值越高，共有1 235條邊和84 個節點在此網絡中。見圖2。拓撲學分析結果見表2。網絡BC 中位數為0.001 179 64，Degree中位數為29，CC 中位數為0.630 032 205，ALB（血清白蛋白）、IL-6（白介素-6）、CASP3（胱天蛋白酶3）、EGF（表皮生長因子）、EGFR（表皮生長因子受體）、PTGS2（前列腺素G/H 合成酶2）、IL-1B（白介素 -1B）、ESR1 （ 雌 激 素 受 體 1）、CCND1（G1/S-specific 周期蛋白D1）等24 個靶點滿足上述參數卡值，可作為治療作用的核心靶點，在治療作用中有可能占據了重要地位。

表2 24 個核心靶點蛋白拓撲學參數信息

圖2 益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合靶點蛋白高置信度PPI 網絡

2.3 富集分析 128 個分子功能（Molecular Function, MF） 條 目、60 個 細 胞 組 分（Cellular Component,CC）條目和1 980 個P≤0.05 的生物過程（Biological Processes,BP）條目和總共2 168 個條目通過GO 富集獲得，這些條目涉及到的作用主要有凋亡信號通路的調控、對類固醇激素的反應、活性氧代謝過程、對氧水平的反應等，選取分子功能、細胞組分以及生物過程P值最小的前10 個條目進行作圖。見圖3。其中橫坐標代表GOID，縱坐標代表富集的基因數目。表3 展示了以上30 個生物學過程富集信息。133 條P≤0.05 的信號通路利用KEGG 富集獲得。見圖4。主要以涉及糖尿病并發癥的晚期糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、前列腺癌、膀胱癌、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、丙型肝炎、胰腺癌、人類巨細胞病毒感染、IL-17 信號通路、麻疹、p53 信號通路、內分泌的阻力、結腸直腸癌、HIF-1 信號通路等為其中較為顯著的生物學富集通路。其中以橫坐標代表該通路富集的基因數目，以縱坐標代表富集的顯著生物學通路，P值的大小通過顏色的深淺代表。該生物學通路的P值越小、越顯著則表現出的顏色越紅。通過Cytoscape 軟件將P值前20 的信號通路構建“靶點-通路”。見圖5。從圖中可見益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的可能靶點在多個不同的代謝通路分布，聯手調節機體水平，反映了益氣化瘀補腎方多成分、多靶點治療骨延遲愈合的作用機制。

圖4 益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的KEGG 富集分析圖

圖5 益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合-靶點-通路圖

表3 益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的GO 富集分析信息

圖3 益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的GO 富集分析圖

3 討論

腎中精氣為骨生長發育的根本，肝主筋，腎主骨生髓，人至中老年體質虛弱，耗傷腎精，致腎精虧虛，精虧髓減，腎氣不足，氣機升降失常，血行不暢而致瘀血，血瘀進一步影響氣的生成和運行，腎氣愈虛。

益氣化瘀補腎方是施杞教授基于石氏傷科“以氣為主，以血為先，痰瘀兼顧，肝腎同治”理念，結合“益氣、化瘀、補腎”的治法所創立，由黃芪、黨參、當歸、川芎、桃紅、紅花、丹參、肉蓯蓉、淫羊藿、蒼術、赤芍、生地黃、補骨脂共十三味藥組成。《日華子本草》認為黃芪“助氣壯筋骨，長肉，補血，破瘕癖”。益氣化瘀補腎方中黃芪、川芎益氣活血，為君藥；黨參、丹參活血化瘀，為臣藥；肉蓯蓉、補骨脂滋補肝腎，為佐藥。全方共奏益氣化瘀、補腎通絡之功效?，F代藥理研究顯示，黃芪的主要成分黃芪多糖對成骨細胞增殖、活性有雙向調節作用；黃芪、川芎具有增強骨小梁面積及數目、增加松質骨骨密度的作用；黨參、丹參具有抗骨質疏松的功效；肉蓯蓉、補骨脂具有增加成骨細胞數量的作用。方中活性成分達到154 種，通過84 個交集靶點和154 種活性成分構建藥物-靶點-疾病網絡，并進行拓撲學分析，顯示成分中的Quercetin （槲皮素）、Luteolin （毛地黃黃酮）、Kaempfero（山柰酚）、Wogonin（漢黃芩素）、Baicalein（黃芩甙元）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）和ellagic acid（鞣花酸）等56 種活性成分可能是益氣化瘀補腎方的關鍵活性成分，是其發揮治療骨延遲愈合作用的關鍵。槲皮素是本研究中主要活性成分度值排名最高的，其作為黃酮醇類化合物，具有多種生物活性，廣泛分布于植物界，能發揮抗氧化、抗炎、抗病毒、降糖、抗腫瘤、降脂、調節免疫等多種作用[8～9]。實驗研究發現槲皮素處理后骨鈣素增加，骨源性堿性磷酸酶及雌二醇存在減少，槲皮素可以顯著影響骨質疏松大鼠及小鼠的骨代謝，促進成骨[10～11]，同時也促進老年性骨質疏松患者的骨代謝指標，提高老年患者臨床治療效果[12～13]。毛地黃黃酮與槲皮素同屬總黃酮類，具有殺菌、消炎、收斂功能[14]。山萘酚可通過調節Ca2+代謝平衡，促進骨膠原生成，減少骨小梁丟失、增強成骨細胞活性，抑制瘢痕成纖維細胞的生長[15～16]。

PPI 網絡結果顯示，益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的核心靶點包括ALB、IL-6、CASP3、EGF、EGFR、PTGS2、IL-1B、ESR1、CCND1 等24 個。ALB是評估機體營養狀況的重要指標，機體營養不良易造成患者感染的概率上升[17]。IL-6 作為重要的炎癥參與因子，增加TNF-α 參與組織損傷，誘導產生前列腺素誘導炎癥反應是其誘導炎癥反應的主要機制。Casp3 則是比較特殊的靶點，Casp3 主要編碼細胞凋亡執行階段的關鍵蛋白酶[18～20]，EGF 是一種由53 個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽，EGF與靶細胞上的EGF 受體特異性識別結合后，發生一系列生化反應，最終可促進靶細胞的DNA 合成及有絲分裂[21]，促進細胞增殖和組織修復[22]。EGF 無糖基部位，非常穩定，耐熱耐酸，廣泛存在于體液和多種腺體中，主要由頜下腺、十二指腸合成，在人體的絕大多數體液中均已發現，在乳汁、尿液、精液中的含量特異性地增高，但在血清中的濃度較低[23]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[24～25]。這些結果提示，益氣化瘀補腎方可能通過軟骨細胞凋亡、調控機體營養水平、細胞自噬或凋亡/炎癥細胞因子激活等途徑的靶點發揮治療骨延遲愈合作用。

通過KEGG 通路富集分析的結果可以看出，益氣化瘀補腎方對骨延遲愈合的干預機制最有可能與涉及糖尿病并發癥的AGE-RAGE 信號通路、前列腺癌、膀胱癌、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、丙型肝炎、胰腺癌、人類巨細胞病毒感染、IL-17 信號通路、麻疹、p53 信號通路、內分泌的阻力、結腸直腸癌、HIF-1α 信號通路等相關，GO 分析結果表明，益氣化瘀補腎方干預骨延遲愈合過程在生物過程方面最可能與對營養水平、金屬離子及抗生素的反應相關，在細胞組分方面最有可能與囊泡、膜區、膜促性腺激素等相關，而在分子功能方面則最可能與DNA結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、細胞因子受體結合等相關。綜上所述，對益氣化瘀補腎方進行網絡藥理學的研究表明該方通過多個成分作用于多個靶點、多條通路聯合實現對骨延遲愈合的治療作用。這些靶點和通路的作用主要涉及機體營養水平、細胞凋亡、致炎因子、細胞生長因子、VEGF 等，提示益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合的作用機制與調節機體營養水平、抗炎、促進血管新生、干預細胞凋亡相關，為后期深入研究益氣化瘀補腎方治療骨延遲愈合提供了理論基礎。