從江及周邊地區稻田鯉的遺傳結構及系統發育關系

余科 麻智芳 安苗 羅均 黃勝 梁志強 邵儉 潘秋芝任芳 龍金梅

(1.貴州大學動物科學學院,高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州省黔南州農業科學研究院畜牧水產所,都勻 558000;3.貴州省從江縣農業農村局,從江 557400;4.湖南省水產科學研究所,長沙 410153;5.貴州省錦屏縣農業農村局,錦屏 556700)

鯉(Cyprinus carpioLinnaeus)是一種有著幾千年的文化史和馴養史的魚類,在全球100多個國家進行養殖,產量居世界的第四位和中國養殖魚類的第四位[1,2]。鯉亞種的分類及系統發育關系多有爭議,Kirpichnikov[3]基于形態差異提出外高加索鯉C.c.carpio、中亞鯉C.c.aralensis、遠東鯉C.c.haematopterus和東南亞鯉C.c.viridiviolaceus四個亞種,而后外高加索鯉和中亞鯉被證實有共同祖先[4],合用C.c.carpio一個亞種名[5]。東南亞鯉的有效性同樣受到質疑[6],Steffens[7]認為它可能來自中國。Balon[8]基于形態和生理特征只認可歐洲鯉和東亞鯉2個野生亞種,伍獻文[9]基于形態和地理分布差異,提出外來的西鯉、遠東鯉和華南鯉3個亞種,并成為我國鯉魚資源調查中關于形態和分類的主要依據,分子遺傳學研究也支持華南鯉是遠東鯉分離的一個亞種[10—12]。由于地理隔離、適應性突變積累、自然和人類的選擇壓力綜合作用,鯉已經發展出許多種群和品系[13],我國擁有世界上數量最多的鯉天然種群、馴化品系和人工品種[14],其中從江田魚C.c.congjiangensis[15]、湖南呆鯉[16]、廣西金邊鯉C.c.var.jinbian[17]、曬江鯉[17]和桂林禾花鯉[18]等地方性稻田鯉備受人們關注,并在傳統稻魚共生系統中發揮著重要作用。

從江縣隸屬貴州省黔東南苗族侗族自治州,地處都柳江中下游,周邊與榕江、黎平、廣西融水和三江等縣接壤,東北部與錦屏、湖南的通道和靖州等縣比鄰,是我國南方湘黔桂苗、侗族聚居的核心區,少數民族風情獨特,稻田鯉馴養已有上千年[19,20]。根據外形和體色有烏鯉、荷包鯉和火鯉等當地俗稱品種[19,21],它們具有性情溫順、抗病力強、活動力弱和不善跳躍等特點,在稻田淺水環境不易逃遁,統稱“呆鯉”或“田魚”,又因以稻田禾花為食而稱“禾花魚”,現今許多村寨現仍延續著自繁自養自留種的繁養體系。本地鯉與糯禾構成了一種稻魚共生和魚米同收的生態農業模式,2011年從江侗鄉稻魚鴨復合系統獲聯合國“全球重要農業文化遺產”授牌,融水田鯉和從江田魚等先后獲得全國農產品地理標志,極大地促進了稻田鯉的養殖利用。然而,隨著現代農業技術的應用和大量外來鯉品種涌入[17,22,23],稻田本地鯉的生存受到嚴重威脅[24,25],種質面臨混雜風險。

目前,從江及周邊苗侗族地區稻田鯉的種質特性研究步伐不斷加快,袁振興[26]研究了都柳江野鯉的遺傳多樣性,郭梁等[15]將從江田魚與青田田魚C.c.qingtianensis進行了形態學對比分析,兩種“田魚”在形態上明顯區別于其他鯉魚種群或品系,廣西稻田鯉的遺傳結構的研究也取得了一定成果[17,18,27,28]。然而從江及周邊苗侗族地區稻田鯉的遺傳背景我們還知之甚少,分類地位及其系統發育關系仍不確定,嚴重阻礙了其種質保護和育種利用。系統發育分析可闡明魚類種群之間系統發育關系,揭示種群和品系鮮為人知的混雜史,有助于遺傳育種和種質保護工作[14],mtDNA是系統發育研究中最常用的遺傳工具,細胞色素b(Cytb)是系統發育分析中最常用的基因區[11]。為此,本文基于線粒體Cytb基因標記技術,對從江及鄰近6個縣稻田鯉的遺傳組成及系統關系開展研究,揭示傳統稻魚復合生態系統中鯉的種質特征,旨在為鑒定與評價這一獨特的農業文化遺產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稻田鯉分別采自貴州、廣西和湖南3省的從江、榕江、黎平、錦屏、三江、靖州和通道等7個縣22個鄉鎮28個村寨(表1和圖 1)。其中,從江縣全境設置12個鄉鎮16個村寨;榕江、黎平和錦屏3縣設置6個鄉鎮7個村寨;廣西三江縣設置2個鄉鎮3個村寨;湖南的靖州和通道2縣設置2個鄉鎮2個村。每個村寨盡量選取有自繁自育自留種習慣的1家農戶,放低稻田水位徒手捉魚,根據捕獲鯉魚多寡從中隨機挑選尾數不等的活魚樣品。現場測量體長和體重等常規生物學指標,取背部肌肉3—5 g浸泡于95%乙醇溶液試管中,置于保鮮冰盒回校后放入-80℃冰箱中保存備用。

圖1 采樣點Fig.1 Sampling Site

表1 樣品采集信息Tab.1 Sample collection information

1.2 實驗方法

提取DNA 利用DNA提取試劑盒(北京天根)提取肌肉樣品基因組DNA,通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其完整性,再利用紫外分光光度計(Thermo Nano Drop 2000C)測定其吸光值。最后置于-20℃保存備用。

引物的篩選與PCR的擴增Cytb擴增引物的序列為L14724:5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′,H15915:5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[29],送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系為25 μL:模板DNA 2.5 μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物分別為1.25 μL,剩余體積用雙蒸水補齊。反應程序:94℃預變性3min,94℃變性40s,52.5℃退火40s,72℃延伸50s,重復35個循環,最后再72℃終延伸7min,4℃保存備用。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗,選擇特異性強的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.3 數據處理與分析

測得的上下游序列利用DNAStar5.0軟件包中的SeqMan進行拼接并手工校對。從NCBI上下載廣西禾花鯉(MK088487)完整Cytb基因序列,比對保留相同序列長度。運用Mega6.06軟件[30]對不同序列間的堿基組成進行統計,基于K2-P模型計算群體間的遺傳距離[31]評價遺傳差異,收集NCBI基因庫中國內外鯉的Cytb基因序列與本研究單倍型序列,基于K2-P模型構建不同單倍型間的NJ(Neighbor-Joining)和MP(Maximum parsimony)系統進化樹,同時運用MrBayes 3.2.7[32]構建貝葉斯系統樹(Bayesian inference,BI),循環運算設置10000000代,每隔1000代進行樣本抽樣,運算停止后用TreeGraph 2.15.0[33]繪制系統發育圖。利用Network5.0軟件[34],以中介鄰接網絡算法(MJ,Median-joining networks),按照單倍型頻率繪制神經網絡圖,展示單倍型之間的衍生和進化關系。用DnaSP 5.10軟件計算單倍型數(Number of haplotypes,H)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)、多態位點數目(Number of polymorphic sites,S)和平均核苷酸差異(Mean number of pairwise differences,K)等多樣性評價參數。運用Arlequin3.5軟件[35]進行變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA),檢測遺傳變異來源,并計算群體間的分化系數。

2 結果

2.1 稻田鯉Cyt b基因的堿基組成和單倍型分布

447條長度為1141 bp的Cytb基因同源序列,共檢測出54個變異位點,無堿基的插入和缺失,有5個顛換和49個轉換,轉換與顛換比為11.23,轉換主要發生在堿基G與A之間,占總變異的48.1%,略高于T與C轉換比的42.6%。堿基T(U)、C、A、G的平均含量分別是26.3%、29.9%、29.9%、14.0%,A+T的平均含量為56.2%大于 C+G 的平均含量43.9%。共界定了29種單倍型(MW683933—MW 683961),單倍型的分布見表 2,其中獨有的單倍型18個,共享的11個。從江群體擁有最多的單倍型(19)和獨享單倍型(8),與周邊5個稻田群體有11個共享,Hap1、hap3-hap5和hap8是其優勢單倍型。榕江群體無獨有單倍型,廣西三江有1個,黎平有4個,錦屏2個,湖南有3個。Hap3、hap5、hap8、hap11、hap15和hap16在6個稻田鯉群體間廣泛分布,代表296尾個體,占總樣本數的66.22%。

2.2 稻田鯉的系統發育關系及單倍型神經網絡圖

以鯽Carassius auratus auratus和三角鯉C.multitaeniata為外群,29種單倍型與歐亞鯉的39條Cytb基因序列構建NJ、MP和BI系統發育樹,聚類結果基本一致,其中MP系統樹見圖 2。

68條鯉Cytb基因序列(1124 bp)以100%置信度聚在一起,嚴格劃分為2大譜系(Clades)。Clade A由4個單倍型和歐洲鯉的4條序列以98%置信度聚類,下分2個亞支subclades(a1和a2),hap22及其衍生的3個單倍型組成a2,它們隸屬歐洲鯉亞種。Clade B由剩余的25個單倍型和亞洲的35條鯉序列以64%置信度構成,其下分為7個亞支,其中b1、b3、b4和b5亞支中含17個單倍型,它們分別與珠江野鯉、元江野鯉、都柳江野鯉、紅河的華南鯉、廣東大肚鯉Big-belly carp、金邊鯉和桂林禾花鯉等聚類,分類上屬華南鯉亞種;b2、b6和b7亞支中8個單倍型與日本鯉霞浦湖鯉、長江野鯉、興國紅鯉C.c.var.xingguoensis、荷包紅鯉C.c.var.wuyuanen-sis、日本錦鯉C.c.Koi、青田田魚和俄羅斯散鱗鏡鯉Russian scattered scaled mirror carp聚類,屬遠東鯉亞種。

結合表 2統計,歐洲鯉亞種4個單倍型魚的33尾樣品分布于除錦屏外的5個群體,三江(15)和從江(10)的數量最多;遠東鯉亞種8個單倍型魚的44尾樣品在6個群體都有分布,從江(26)和湖南(9)的數量最多;華南鯉亞種17個單倍型魚的370尾樣品在6個群體也有分布,且都是其優勢的類群。

表2 單倍型分布Tab.2 Haplotype distribution

29個單倍型的神經網絡圖(圖3)劃分為三個區(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ):Ⅰ區與Clade A對應,與其他2個區之間的突變步驟較長,湖南通道的hap22進化出另外3個單倍型,在從江、榕江、黎平和三江擴散開來。Ⅱ區對應Clade B的b1亞支,由從江和黎平各自2個獨有單倍型組成,因3個未知的單倍型缺失而在該區相互獨立分布。Ⅲ區是一個龐大的家族,Hap5和hap18與其余單倍型之間因存在1—2個缺失的單倍型,而略顯獨立,與圖 2中Clade B的聚類情況一致,剩余的單倍型都以從江的Hap7為網絡中心向外輻射發展進化而來,顯示其祖先的等級。

圖2 鯉mtDNA Cyt b基因單倍型的MP系統發育樹Fig.2 MP Phylogenetic tree of mtDNA Cyt b gene haplotypes in C.carpio

2.3 稻田鯉的遺傳多樣性

如表 3所示,歐洲鯉為低Hd和低π,其遺傳多樣性值遠低于亞洲的鯉魚類群,亞洲的2個鯉亞種群體以華南鯉遺傳多樣性最高。在華南鯉群體中,從江具有最高的多態位點數、單倍型數和單倍型多樣性,黎平具有最高的核苷酸多樣性,錦屏的Hd和π都最低。

表3 稻田鯉群體的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity of rice field carp populations

2.4 稻田鯉群體間的遺傳差異及遺傳分化

如表 4所示,6個華南鯉稻田群體間的遺傳距離為0.0016—0.0036,以黎平與從江和三江之間差異最大,其次是三江與從江和湖南,湖南與從江和黎平以及榕江與錦屏之間差異最小。遺傳分化指數在0.0345—0.4233,錦屏與其他群體之間的遺傳分化最大,其次是三江群體,其他群體間的數值較小。2個譜系間的遺傳距離為0.0129,亞種間為0.0128、0.0129和0.0038,說明譜系間或亞種間的遺傳差異水平高于6個華南鯉群體。譜系間或歐洲鯉與遠東鯉和華南鯉之間分化值最高,遠東鯉與華南鯉之間最低。

表4 稻田華南鯉群體間的遺傳距離和遺傳分化指數Tab.4 Genetic distance and genetic differentiation index among the rice field carp populations (C.c.rubrofucus)

6個華南鯉群體按省劃分3組:第1組為貴州省的從江、榕江、黎平和錦屏4個群體,第2組為湖南群體,第3組為廣西三江群體,其AMOVA結果見表 5。組間的變異貢獻率為2.17%,群體間為16.69%,群體內為81.14%。這說明稻田華南鯉的遺傳變異主要來源于群體內個體間,其次才是地理群體間。遺傳分化指數Fst=0.167,并且差異極顯著(P＜0.0001)。

表5 基于mtDNA Cyt b序列的分子方差分析Tab.5 Molecular analysis of variance (AMOVA) based on mtDNA Cyt b sequence (AMOVA)

3 討論

3.1 稻田鯉的亞種地位及其母系血統來源追蹤

我國3個鯉亞種主要是分布于新疆額爾齊斯河流域的西鯉、黑龍江至閩江的遠東鯉及珠江、元江、海南島等地的華南鯉[9]。系統發育樹顯示,本研究29種單倍型嚴格劃分歐洲和亞洲2個地理譜系,Clade A中4個單倍型與歐洲鯉聚類,blast比對也發現,hap22與希臘鯉(EU689059和DQ868871)和伏爾加河鯉(AY347295)的相似度為99.91%,另外3個單倍型與其相似度為99.56%—99.74%,表明該4種單倍型隸屬歐洲鯉類型。我國自20世紀50年代起陸續引進散鱗鏡鯉C.c.var.specularis amurensis和德國鏡鯉C.c.var.specularis germanensis等歐洲馴養鯉[36,37],以它們為母本獲得芙蓉鯉C.c.“Furong”和穎鯉C.c.“Ying hybrid”等人工品種,本地區也有引種養殖的歷史[22,23,36]。4種單倍型魚33尾樣品在錦屏外其他5個稻田群體都有分布,揭示從江及鄰近地區稻田鯉受到歐洲馴養鯉母系基因的遺傳滲析。Clade B劃分7個亞支,b2、b6和b7中的8個單倍型魚與長江野鯉、青田田魚、興國紅鯉、荷包紅鯉、日本錦鯉和俄羅斯散鱗鏡鯉等遠東鯉的類群或品系[11]聚類,表明其遠東鯉亞種地位。Hap18與日本霞浦湖鯉和水生所上傳鯉的序列相似性達100%,Mabuchi等[38]認為霞浦湖鯉系引進的歐亞品系,該單倍型魚只有1個個體,可能為輸入型。Hap6、hap7和hap26分別與荷包紅鯉的序列相似度達99.82%—100%,3個單倍型顯示是荷包紅鯉的母系起源。Hap10、hap12和hap21與長江野鯉和興國紅鯉相似度為99.91%—100%,hap13與荷包紅鯉相似度為99.74%。8個單倍型魚與興國紅鯉和荷包紅鯉的同源性較高,預示其相同的母系來源,該地區有興國紅鯉和荷包紅鯉及其雜交品種(如豐鯉、荷元鯉、岳鯉和建鯉等)的推廣養殖歷史[22,39]。8個單倍型魚的44尾樣品在6個稻田鯉群體中都有發現,說明本地區稻田鯉同樣遭受國內鯉養殖品種的母系遺傳物質滲入。

b1、b3、b4和b5顯示是華南鯉亞種地位及其地理種群或地方品系的母系血統。b1亞支中4個單倍型在神經網絡圖中(圖3)處于獨立的Ⅱ區,系統樹中也相對獨立,與其他亞支關系較遠,但它們與珠江、都柳江和紅河的鯉魚以81%置信度聚類在一支,歸屬華南鯉亞種是比較合適的,Hap14和hap17分別與珠江野鯉(KP993137)和都柳江野鯉(KY949559和KY949549)的相似性達100%,Hap27和Hap29與其相似度最高只有99.47%而獨立為小支,4個單倍型魚與都柳江野鯉高度同源。Hap5與廣東大肚鯉和都柳江野鯉序列相似度達100%,Zhou等[10]指出廣東大肚鯉和元江野鯉都屬華南鯉亞種,Hap5代表的32尾魚以從江的21尾最多,其次是榕江和湖南通道各4尾,廣西三江2尾和湖南靖州1尾最少,本支中也含都柳江野鯉的3個單倍型魚,它是否為本地區所有或來自廣東還不能確定。b4中含有多達8個單倍型,Hap16、hap24和hap25分別與桂林禾花鯉相似度最高(100.00%、99.91%和99.74%),hap3和hap8與都柳江野鯉(KY949560和KY949562)的相似性最高(100%),與金邊鯉為99.91%和99.82%,另外3個單倍型與都柳江野鯉的序列相似性最高為99.91%、99.91%和99.82%,其次才是與金邊鯉(99.82%、99.74%和99.74%)。潘賢輝等[18]研究指出桂林禾花鯉和金邊鯉群體關系較近,推測由珠江水系右江的野生鯉演變而來,程磊等[28]指出廣西禾花鯉母系起源上屬華南鯉。8個單倍型魚與桂林禾花鯉、都柳江野鯉和融水金邊鯉有相同母系血統來源,3地鯉魚分布區彼此鄰近,民族同根同源,文化、習俗和稻作方式相同,有稻田鯉的苗種交流與養殖推廣報道[17,19,27,40],前3個單倍型魚(92尾樣品)分布在三江外的5個稻田群體中,主要分布于桂林禾花鯉分布區全州縣鄰近的錦屏(55/60)、黎平(16/43)和湖南 (11/50),后5個(有185尾樣品)廣泛分布3省7個縣的稻田中,主要集中在都柳江流域的從江(115/203)、三江(13/55)、榕江(18/36)和黎平(13/43)四地,說明b4亞支是本區域稻田中分布最集中的華南鯉類群。b5亞支中的hap4、hap15、hap20和hap23與都柳江野鯉和元江鯉聚類,相似度為99.82%—100.00%,四個單倍型魚也屬華南鯉亞種,51尾樣品魚主要分布于從江(23尾)和三江(22尾)。

圖3 單倍型的神經網絡圖Fig.3 Neural Network Diagram of haplotypes

3.2 稻田鯉群體的遺傳結構

稻田鯉遺傳多樣性統計表明,分布于稻田中歐洲馴養鯉群體為低Hd低π,多樣性匱乏。雖然本研究樣本數有限,但前期關于歐洲鯉mtDNA多個基因區分析也同樣表明其遺傳變異程度極低[4,41,42],推測歐洲養殖和馴養鯉的早期存在瓶頸效應或奠基者效應[12],導致遺傳變異的局部丟失[8]。稻田中遠東鯉和華南鯉2個亞種群體都為高Hd低π,Thai等[42]研究也指出中國鯉與歐洲鯉相比,其進化歷史更長,表現出相當高的單倍型多樣性和差異性,本研究稻田鯉的2個亞種群體也有同樣特點。稻田中最大的華南鯉群體也顯示是多個母系血統混合體呈高Hd(0.854),說明多個母系血統來源的鯉品系混養和缺乏人工定向選育,能較大程度保持現有稻田鯉的基因型多樣性[28],然而錦屏群體的低Hd低π有點例外,統計發現59尾樣本中有53尾歸屬hap16(啟蒙鎮便幌村21尾、啟蒙鎮岑根村14尾和敦寨鎮螺絲田村18尾),啟蒙鎮便幌村是一個典型自繁自育自留種的稻田鯉養殖點,樣品魚遺傳同質化,提示為創始者事件和瓶頸效應的結果,Perdices等[43]指出廣泛的采樣可能會發現更多的線粒體譜系,因此錦屏稻田鯉群體遺傳多樣性正確評價有待今后擴大采樣范圍。從江群體具有廣泛采樣和大樣本量,其單倍型數最多,Hd也最高,但其π仍偏低,5個地理群體高Hd低π特點屬魚類多樣性第二種類型 (h＞0.5,π＜0.005)[44],遺傳多樣性水平與該物種的進化速率正相關[45],Zhou等[11]提出華南鯉與遠東鯉的分歧時間在中更新世,由于進化歷史相對較短,加之經歷過較嚴重的遺傳瓶頸[46]和種群擴張[47],說明華南鯉在經歷瓶頸效應后,進化快速,積累了豐富的單倍型多樣性,但核苷酸突變積累略顯不足。

本研究稻田鯉的譜系或亞種間遺傳分化水平存在明顯差異,Clade A與Clade B間的遺傳距離(0.0129)和遺傳分化指數(Fst=0.7934,P＜0.001)都顯示出較大的遺傳差異和顯著的分化,歐洲鯉與亞洲的2個亞種鯉間同樣有較高遺傳差異(0.0128和0.0129)和分化水平(0.8902和0.8058),這符合歐洲和亞洲2個鯉群體古老分離的觀點[10]。亞洲的2個鯉亞種間遺傳距離(0.0038)和遺傳分化(0.3258)明顯偏低,顯示在系統樹中2個亞種未能獨立成單系群,Zhou等[11]認為這種低水平遺傳差異能與其分歧時間較短有關。本研究6個稻田華南鯉群體間的遺傳分化指數為0.0345—0.4233,其中錦屏與另外5個群體間處于高度-中度分化等級[48],三江與剩余4個群體也處于高度-中度分化等級,其余群體間為低度或無分化等級。華南鯉有17種單倍型,雖然共享單倍型有8種,且樣品數占比較高(342/370),但共享單倍型數和樣品數都集中分布在鄰近的2—3個地理種群間(如從江多達160尾),說明共享單倍型魚在6個群體間的傳播是有限的,而獨有單倍型比例高達半數以上(9/17)。AMOVA分析顯示,群體間遺傳變異貢獻率為16.69%,處于中等遺傳變異,說明群體間及其內部均各自具有相互隔離的遺傳結構[27]。這可能與各地理群體存在不同的創始群體、不同的選擇壓力和地理隔離等限制其基因流動的結果[49]。

3.3 稻田鯉遺傳資源的保護和研究

程磊等[22]基于D-loop區和Cytb基因在廣西禾花鯉中觀察到少量歐洲鯉和遠東鯉的入侵,本研究基于mtDNA Cytb基因的分子系統發育結果同樣發現從江及鄰近苗侗族地區稻田鯉受到歐洲鯉和遠東鯉馴養品系的入侵,樣品數占總樣本量的17.23%(77/447),說明本地區稻田鯉遭受國內外鯉馴養品系混雜的程度較為嚴重。因此,加強外來人工品種在稻田推廣養殖的監管和追蹤十分必要。

另一方面,線粒體基因組中不同的基因和區段具有不同的進化速率,在系統發育分析中有時會產生顯著的差異[14],當聯合mtDNA多個基因序列時,系統發育關系的分辨率和準確性會更高[50]。本研究借助Cytb基因的遺傳分析,初步闡明了從江及鄰近苗侗族地區稻田鯉的系統關系、遺傳組成及種群結構,獲得了第一手寶貴資料,但是否遭受國內外鯉品系父系基因遺傳滲析仍不得而知,需進一步聯合多個核內外基因的檢測和分析技術,綜合評價該區域稻田鯉的種質特征。