基于人工培養的浮萍快速無性繁殖營養條件研究

高曉鈺 曹特 倪樂意 張霄林 丑慶川

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態和生物技術國家重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049)

近年來,隨著全球能源物質和高蛋白動物飼料短缺,傳統的農作物如小麥、玉米等帶來碳水化合物的同時也增加了對糧食耕地的競爭[1],科研人員正在尋求一種替代、可再生、更持續的能源物質和優質飼料[1,2]。因此,探索新型非食品原料以促進可持續生物能源生產及飼料開發成為一種新的趨勢[3—5,6]。研究發現,浮萍科(Lemnaceae)植物具有快速吸收水體氮磷、可耐受多種不同污染物[7,8]等優勢,并含有豐富的淀粉和蛋白質,且年生物質產量遠高于玉米、小麥和大麥等大多數淀粉作物[4,9]。因此,利用浮萍的快速生長特性吸收富營養水體中的營養物質,并將其轉化為有價值的植物生物質能源[10],必將是今后浮萍資源化開發利用的主要發展方向。

浮萍科植物(Lemnaceae),通常簡稱浮萍,是世界上最小的水生被子植物[11,12],在全球各地均有分布,它們大多漂浮生長在水流相對平緩的湖泊、河灣和池塘等水面上。浮萍亞科共有青萍(Lemna)、紫萍(Spirodela)、少根紫萍(Landoltia)、無根萍(Wolffia)和扁無根萍(Woffiella)5個屬,共37種[13,14]。各個屬之間大體上可以通過根的數目和葉的形狀進行區分。浮萍科主要的繁殖方式是無性繁殖,即母體通過發芽產生子葉狀體[5,15],在氮磷等營養物質充足的前提下,浮萍近乎以指數級繁殖速率增長,但倍增時間因品種和生長環境而異[5],且隨著種群密度的增大繁殖速率逐漸降低。浮萍通過吸收其生長環境中的氮磷等營養物質實現無性繁殖,目前國內外關于浮萍生長規律的研究中,因培養基種類和氮磷的存在形式及比例不同,導致浮萍的生長存在差異[16],而優化浮萍人工培養技術以實現短期內收獲最大生物量,進而用于污染水體修復和生物質能源資源化利用等十分重要。基于此,本研究選取了水生植物培養常用的Hoagland和Hunter兩種培養基,于室內進行浮萍無性繁殖人工培養,以期選擇出最適合浮萍生長繁殖的培養條件,從而為浮萍可持續再生的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 種質資源采集

本研究所用S.polyrrhiza和L.minor于2019年5月采自武漢東湖(N 30°32′,E 114°21′)。主要通過葉的形狀、顏色和根的數目進行區分,L.minor葉片正反面皆為綠色、葉膜質和單根,而S.polyrrhiza葉片正面紫色、反面綠色、葉革質和多根(圖1)。采集后用流動自來水沖洗掉浮萍上的碎屑和小型無脊椎動物等殘留物[17]。隨后將浮萍置于實驗室可接受自然光照射的水箱中生長1周,待其適應后開始人工培養。

1.2 實驗設計

本研究通過配制人工培養液來模擬富含無機氮磷的水體,探究S.polyrrhiza和L.minor在不同濃度培養液中種群生物量和葉狀體數的生長變化,初步確定浮萍生長的最適培養條件。

根據已有的研究[18—20],本研究選用Hoagland(表1)和Hunter(表2)兩種培養基[19,20],分別設置原液、稀釋5倍和稀釋10倍3個濃度梯度,每個濃度設置3個重復。選取長勢良好、生長健壯的S.polyrrhiza和L.minor各5株放入培養皿(直徑9 cm,高1.5 cm)內,液面高度為培養皿高度的2/3。由于培養液會自然蒸發,故每天補充蒸餾水到培養皿高度的2/3,每隔2天更換新鮮培養液,從而保證培養液中各個組分濃度穩定和防止藻類、菌類滋生。每次更換培養液的同時將浮萍在濾紙上靜置5min吸干表面水分,稱量鮮重并逐個測定葉狀體數[21]。人工培養所用培養箱為智能型人工氣候箱(MGC-350HP型),光照設定為二級,光照強度為8000—10000 lx[22],晝夜溫度分別為(25±1)℃和(17±1)℃,光暗時間比16h∶8h[19]。由于S.polyrrhiza葉狀體在13d以后出現肉眼可見的黃化,有的個體甚至死亡,故停止浮萍的培養,培養期為13d。

表1 Hoagland培養基及稀釋后的濃度配方Tab.1 The formula of Hoagland medium and diluted concentrations

表2 Hunter培養基及稀釋后的濃度配方Tab.2 The formula of Hunter medium and diluted concentrations

1.3 生長指標的測定

鮮重(Fresh Weight,FW)在培養期內,每隔2d測定浮萍的鮮重。利用漏斗網從培養皿內撈取聚集在一起的浮萍,濾去水分(無水滴出現),將待測浮萍平鋪放置在事先鋪好的吸水濾紙上,靜置5min吸干表面吸附的水分,用電子天平(METTLER TOLEDO,精度為0.0001 g)對培養皿內的浮萍進行稱重記錄,鮮重測量完成后立即將浮萍放入更換好的新培養液中繼續生長[19,21]。

葉狀體(Frond)浮萍葉片組織結構高度退化,其葉通常被稱為“葉狀體”(Frond),是一些具有最小分化組織的集合體。成熟的株體從葉狀體邊緣分生新芽孢,母體脫離后形成新的葉狀體分株,數代相連。每隔2d更換新鮮培養液的同時,將待測的浮萍放在電子顯微鏡下方,進行逐株葉狀體計數。

種群生長參數根據公式(1)和(2)分別計算浮萍種群鮮重、葉狀體數的相對增長率(RGR)和倍增時間T[23,24]。

1.4 數據分析

首先,通過繪制浮萍培養期內鮮重、葉狀體數變化趨勢圖,以觀察出不同浮萍品種和培養條件下的生長差異;再利用公式(1)和(2)進行種群生長指標(鮮重和葉狀體)RGR和倍增時間的計算,從而比較出兩種浮萍在不同培養水平下無性繁殖的具體差異;其次,采用雙因素方差分析探究S.polyrrhiza和L.minor在不同培養液中生物量和葉狀體數變化是否具有顯著性差異(P＜0.01),并運用多重比較(LSD)探究兩類培養基的不同濃度水平間是否具有顯著性差異(P＜0.05)。最后,計算浮萍的鮮重葉狀體生長比,比較浮萍在不同培養基營養水平下的繁殖策略。所有統計分析和圖表繪制均使用IBM SPSS 22和Origin 2017軟件進行。

2 結果

2.1 浮萍種群鮮重變化趨勢

S.polyrrhiza和L.minor在Hoagland和Hunter培養基中培養13d后,鮮重的變化趨勢存在顯著差異(圖2)。S.polyrrhiza的鮮重在Hunter培養基各濃度下的增長率高于Hoagland培養基(圖2a)。S.polyrrhiza種群鮮重在Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中起始階段均呈增長趨勢,所達最高增長率分別為14.8%、33.8%和75.5%,培養到8d后鮮重均逐漸下降,種群個體在表觀上呈現黃化,繼而死亡;而在Hunter 培養液各水平中,S.polyrrhiza鮮重在整個培養期內始終呈增長趨勢,Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液的增長率分別達到318.1%、272.1%和171.2%。

S.polyrrhiza在Hunter培養水平下的鮮重RGR值高于Hoagland各培養水平(表3),即在Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中S.polyrrhiza鮮重的相對增長率RGR分別為-0.01、0.02和0.03,而在Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液中RGR為0.08、0.10和0.11,而在相同的培養時間內,RGR越大,種群增長越快,RGR為負值表明植株已受毒害并逐漸死亡,說明S.polyrrhiza在Hoagland原液中種群逐漸死亡,而在Hunter培養液中種群鮮重增長較快。從種群增長倍數和倍增時間可看出,S.polyrrhiza在1/5 Hoagland培養液中,最好的生長表現為20d內倍增數為1.60,而Hunter培養液中6d倍增數即達到4.20。因此,Hunter培養液較Hoagland培養液更有利于S.polyrrhiza的生長。

表3 不同培養條件下紫萍種群鮮重變化(平均值±標準差)Tab.3 Fresh weight variation of S.polyrrhiza population under different nutritional conditions (mean±SD)

同樣,L.minor鮮重在Hunter各培養水平下增長率高于Hoagland各水平(圖2b)。L.minor種群鮮重在Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液的起始增長階段達最高增長率分別為37.3%、95.2%和167.5%,而在8d后鮮重卻逐漸下降;但在Hunter 培養液各水平中,L.minor鮮重培養期間內一直增長,Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液的增長率分別達到895.2%、469.1%和396.3%。

圖2 紫萍和青萍在不同培養條件下的鮮重變化Fig.2 Variation of fresh weights of L.minor (a) and S.polyrrhiza(b) under different nutritional conditions

L.minor鮮重RGR在Hoagland 培養液3種培養水平下分別為-0.03、0.02和0.07,而在3種Hunter培養液中的RGR分別為0.12、0.13和0.18(表4),說明L.minor在Hoagland原液中逐漸死亡,而在Hunter培養液中鮮重生長較好。從種群增長倍數和倍增時間來看,L.minor在1/5 Hoagland培養液中,最好的生長表現為10d內倍增數為2.5;在Hunter原液培養基中第4天倍增數即達到9.90。結果表明Hunter各培養液較Hoagland培養液同樣更有利于L.minor的生長。

表4 不同培養條件下青萍種群鮮重變化(平均值±標準差)Tab.4 Fresh weight variation of L.minor population under different nutritional conditions (mean±SD)

雙因素方差分析表明(表5,P＜0.01)培養基類型及其營養水平所占的方差變異百分比較高為83.3%,物種所占方差變異百分比為3.7%,而物種和培養基交互作用所占方差變異百分比為6.5%,這說明浮萍品種和培養基類型對鮮重相對增長率具有極顯著的影響,兩者之間的交互作用影響也較為顯著。在兩類培養基的不同營養水平下L.minor的總體鮮重增長趨勢高于S.polyrrhiza(圖3);LSD多重比較表明Hunter培養液的3種培養條件和Hoagland培養液的3種培養條件具有顯著性差異,其中Hunter原液的營養環境對于兩種浮萍鮮重RGR更為有利(圖3)。

圖3 青萍和紫萍鮮重RGR在不同培養條件下的多重比較Fig.3 Multiple comparison of fresh weight RGR of L.minor and S.polyrrhiza under different nutritional conditions

表5 青萍和紫萍鮮重相對增長率、葉狀體數相對增長率雙因素方差分析Tab.5 Two-factor analysis of variance of the RGR of fresh weight and frond number of L.minor and S.polyrrhiza

2.2 浮萍種群葉狀體數變化趨勢

S.polyrrhiza和L.minor在Hoagland和Hunter培養基中培養13d后,葉狀體數存在類似鮮重的變化趨勢(圖4)。S.polyrrhiza的葉狀體在Hunter培養基各濃度下增長率高于Hoagland培養基(圖4a)。S.polyrrhiza種群葉狀體數在Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中起始增長階段達到的增長率分別為60.0%、59.2%和113.8%。7—8d后,種群葉狀體呈現明顯的黃化,葉狀體無性繁殖速率下降,葉片出現死亡;而在Hunter各培養水平下呈持續增長趨勢,Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液的增長率分別達到484.7%、440.2%和300.1%,均表現數量上的翻倍。

葉狀體相對增長率RGR值表明,S.polyrrhiza在Hunter培養水平下的葉狀體RGR值同樣高于Hoagland各培養水平(表6)。Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中葉狀體數RGR分別為0.03、0.04和0.06,1/10Hoagland培養液在6d后才開始翻倍;而Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液中的RGR分別為0.11、0.13和0.14,原液中葉狀體數量在1—2d后即開始翻倍增長。這表明在相同培養期內,S.polyrrhiza葉狀體數的變化具有與鮮重類似的生長規律,即Hunter培養液更適合S.polyrrhiza葉狀體的生長。

表6 不同培養條件下紫萍種群葉狀體變化(平均值±標準差)Tab.6 Variation of fronds of S. polyrrhiza population under different nutritional conditions (mean±SD)

L.minor種群葉狀體在Hunter各濃度下增長率也高于Hoagland(圖4b)。其在Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中葉狀體繁殖數所達最高增長率分別為256.5%、242.3%和238.8%;而在Hunter各培養水平下呈持續增長趨勢,Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液的增長率分別達到1102.8%、753.8%和740.2%,顯著高于Hoagland培養基葉狀體的增殖率。

圖4 青萍和紫萍在不同培養條件下的葉狀體數變化Fig.4 Variation of the number of fronds of (b) and (a) under different nutritional conditions

葉狀體相對增長率RGR值表明,L.minor在Hunter培養水平下的葉狀體RGR值高于Hoagland各培養水平(表7)。Hoagland原液、1/5 Hoagland和1/10 Hoagland培養液中葉狀體數RGR值分別為0.06、0.04和0.06,而Hunter原液、1/5 Hunter和1/10 Hunter培養液中RGR值分別為0.16、0.17和0.19。從葉狀體增長倍數和倍增時間可看出,L.minor的葉狀體數在1/10 Hoagland培養液中,12d培養期的增長倍數為2.10,而在Hunter原液中,葉狀體數在第4d增長倍數即達到12.00,表明L.minor葉狀體在Hunter中生長更好。

表7 不同培養條件下青萍種群葉狀體變化(平均值±標準差)Tab.7 Variation of fronds of L.minor population under different nutritional conditions (mean±SD)

雙因素方差分析結果表明(表5,P＜0.01),培養基類型及其營養水平所占的方差變異百分比為81.1%,物種所占方差變異百分比為5.5%,而物種和培養基之間的交互作用影響不顯著,說明培養基類型及其營養水平和浮萍品種對葉狀體的增長具有極顯著的影響。進一步做6種培養水平的多重比較(LSD)表明兩種浮萍葉狀體數增殖在Hoagland培養液3種培養條件下無顯著差異,而在3種Hunter培養液條件下具有顯著差異的,其中L.minor的葉狀體在培養期內的相對增長率要高于S.polyrrhiza,在Hunter原液中達到最大(圖5)。

圖5 青萍和紫萍葉狀體RGR在不同培養條件下的多重比較Fig.5 Multiple comparison of frond number RGR of L.minor and S.polyrrhiza under different nutritional conditions

2.3 浮萍的繁殖策略

兩種浮萍在不同類型培養基及其營養水平下,對鮮重和葉狀體的資源分配策略不同。在培養期內,紫萍分別在Hoagland培養基原液、稀釋1/5和1/10的3種營養水平下,其鮮重比葉狀體數的比值均呈下降趨勢,且1/5 Hoagland和1/10 Hoagland營養液中紫萍葉狀體分株數增加更快(圖6a),表明為了適應生長環境中占主導因素的氮磷等營養水平變化,紫萍種群擴大種的適合度,優先選擇繁衍后代,增大對葉狀體分株數的投資,使得葉狀體數目增加的速度快于鮮重,從而導致鮮重和葉狀體二者的比值呈現下降趨勢。紫萍在Hunter培養基及其不同氮磷營養水平下生長時,其中Hunter原液的紫萍葉狀體分株速率要快于1/5 Hunter和1/10 Hunter,說明在Hunter氮濃度較高的環境下,誘導了紫萍快速繁殖子代來提高種群的存活力和適合度。

同樣,青萍種群的生活史也表現出相似的規律(圖6b)。在培養期內,青萍在Hoagland培養基原液、稀釋1/5和1/10的3種營養水平下生長,其中Hoagland原液的氮磷等營養濃度對于青萍種群的脅迫力最大,致使子代葉狀體繁殖速率最快即鮮重葉狀體比值最低,達到延續種群生存的目的。而在1/10 Hoagland營養液中,由于營養的稀釋,誘導青萍種群以母體生長為主,進而鮮重增加快于葉狀體的繁殖速率。青萍在Hunter培養基及其不同氮磷營養水平下生長時,鮮重葉狀體比值波動不大,整體上均以葉狀體數的繁殖為主。

圖6 紫萍和青萍在培養期內鮮重葉狀體比值變化Fig.6 Variation of the ratio of fresh weight and frond number of L.minor (a) and S.polyrrhiza (b) during cultivation period

3 討論

本研究認為L.minor和S.polyrrhiza兩種浮萍的鮮重和葉狀體無性繁殖在Hoagland和Hunter兩種類型培養基及其不同濃度水平下具有顯著差異。人工培養過程中L.minor在Hunter原液的長勢最好,種群個體數呈現指數型增長,收獲的鮮生物量最大。陳曉等[25]用Steinberg和Hunter培養液室內培養紫萍和青萍,發現兩種浮萍在Steinberg培養液的生長情況較好,而在Hunter培養液生長受到抑制作用,于斌等[23]的研究認為稀脈浮萍、少根紫萍和紫萍在Hoagland培養液中的生長好于Hunter培養液,而與本研究用Hunter培養液獲取的L.minorRGR和S.polyrrhizaRGR相當。導致優勢培養基差異的原因可能是:(1)浮萍的種間差異性,故對培養液中氮磷等營養鹽吸收轉化效率不同[13,16];(2)培養方式的不同,連續培養需定期補充養分和水分,而本研究每隔2天即更換新鮮培養液,兩種培養方式的不同可能導致培養液生化指標變化[12];(3)浮萍的最佳生長pH為6.50—7.50,pH的升高可引起浮萍體內NH3的解離,當大量的NH3通過擴散作用快速穿過細胞時就會對細胞膜造成傷害,因此高濃度的NH3會對植物生長產生抑制作用,同樣NH4+濃度升高也能產生較強的抑制作用[7]。所以連續培養可能會使培養過程中pH過大而導致浮萍NH3中毒,本研究已盡可能避免了這一問題發生。另外,培養初始時采用培養容器的容積不同會影響浮萍的初始生長密度,而浮萍層在培養液表面的覆蓋密度過高或過低都會影響浮萍的生長[26]。對于本研究結果Hunter營養液培養浮萍的效果好于Hoagland培養液,一方面可能由于Hoagland各組分營養濃度較高,抑制了浮萍的生長;另一方面可能是Hunter在合適的pH和營養濃度下,豐富的氮源更有利于浮萍的鮮重和葉狀體分株的增加。研究表明青萍能夠生長的氨氮濃度介于7—84 mg/L,最佳氨氮濃度為28 mg/L,可見青萍富集氨氮的能力較強。在培養過程,青萍的生長速度快于紫萍,表明青萍更能適應不同營養水平的培養液。通過與大量文獻中涉及的浮萍培養條件相比較,可把本研究所探究的營養條件(溫度、光照和Hunter營養液濃度等)作為廣布種L.minor的較優培養條件,繼而實現短時間內收獲較大浮萍鮮生物量和葉狀體數,為進一步資源化利用提供原材料。