高濃度CO2與磷濃度對葛仙米生長和光合作用的耦合效應

郭宏勇 朱俊杰 沈伊潔 王茜 金鵬 夏建榮

(廣州大學環境科學與工程學院,廣州 515006)

葛仙米(擬球狀念珠藻,Nostoc sphaeroidesKutzing)是一種淡水絲狀多細胞固氮藍藻,其主要產地為我國湖北省鶴峰縣,主要生長于水稻田中[1]。葛仙米是我國珍貴的野生食藥兩用藍藻,其營養價值極高,食用歷史悠久,同時它在保健食品、食品添加劑、動物飼料、醫藥、美容及精細化加工等領域具有廣闊的開發應用前景[2—5]。近年來,由于化肥農藥的過度使用,導致野生葛仙米的產量逐年減少[6],合理地開發利用葛仙米資源,構建葛仙米人工高密度培養技術變得迫在眉睫。葛仙米人工培養需要解決其碳源(CO2)和營養鹽(氮、磷)供應等問題。高濃度CO2培養不僅可以為藻類光合作用提供更加充足的原料,它還能提高 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶的活性并抑制RuBP加氧酶的活性,降低光呼吸強度,有利于光合產物的積累。高濃度CO2對藻類光合作用的影響具有明顯的種間差異性。Chu等[7]的研究表明15% CO2濃度連續培養小球藻,其ATP酶活性、光合固碳、甘油和脂質合成酶活性也會增強。盧璐[8]研究中發現高濃度的CO2使葛仙米的光合能力大大地提高,但葛仙米彈性、干鮮重比增大,蛋白質和多糖含量明顯增加。周智[9]在研究大氣CO2濃度對地木耳生長的影響時也發現在高濃度CO2導致其生長速度速率和干重都明顯地增加。

由于葛仙米自身具有一定的固氮能力,所以對營養鹽的需求主要集中在磷的供應上。磷元素參與植物生長發育過程中的各種代謝活動,在細胞結構、物質代謝及信號傳導、光合作用等方面都起著極為重要的作用[10,11],也直接參與了光的吸收與同化、Calvin-cycle 及對一些酶的活性起著調節作用等[12]。Chen等[13]在研究葛仙米對環境中磷的響應機制時,發現磷濃度越高,葛仙米生長越迅速,其光合效率越高。在磷濃度較低時,葛仙米從絲狀成球及小球變到大球的生長過程會受到限制,且光合作用對無機碳的親和力增強[14]。汪豐海[15]研究表明葛仙米多糖、色素含量與培養基磷濃度呈正相關,但是磷濃度較高時會抑制葛仙米球體的破裂。可見磷在葛仙米生長和成球過程中起了非常重要的作用。

但目前國內外有關研究主要側重于CO2濃度或磷濃度單因子變化對葛仙米的生理學影響上,有關兩個因子的耦合效應尚未見報道。本文通過設置不同CO2濃度和磷濃度培養實驗,探討兩者的耦合作用對葛仙米生長和光合作用的效應,為葛仙米人工高密度培養提供理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葛仙米藻種取自湖北師范大學陳雄文教授實驗室,葛仙米小球用玻璃勻漿器勻漿,然后用無菌BG110培養液稀釋用于擴大培養。培養溫度為(20±1)℃,光強為100 μmol·photons/(m2·s),通入無菌空氣,通氣量為500 mL/min。經過20d左右培養得到粒徑為1—2 mm的葛仙米,用于實驗。

1.2 實驗設計

挑選10 g生長狀態良好的葛仙米小球,置于1 L玻璃管中,調整BG110培養液中磷濃度分別為0.088(LP),0.175(MP),0.350 mmol/L(HP),其中MP為BG110中無機磷濃度。分別通入大氣濃度CO2(LC)和2000 ppm CO2(HC),通氣速率為500 mL/min。每組設置3個平行實驗,培養溫度(20±1)℃,光照強度為100 μmol/(m2·s),光照周期12h∶12h。培養7d后收獲用以測定。

1.3 相對生長速率測定

將收獲的葛仙米小球用濾紙吸干樣品表面水分,將樣品置于冰箱中冷凍,然后放置于冷凍干燥機中冷凍干燥,相對生長速率(Relative growth rate,RGR)用以下公式計算[16]:

式中,t1、t2為開始和結束的時間,W1、W2分別代表實驗開始與實驗結束時的干重。

1.4 直徑分布和粒數測定

將收獲的葛仙米小球用網孔直徑不同的篩網進行篩選,分別獲得直徑大小為1—2 mm、2—4 mm、大于4 mm的葛仙米個體,并計數,計算不同直徑的葛仙米群體所占的比例。

1.5 葉綠素a含量測定

將冷凍干燥的葛仙米加入100%的甲醇,然后在60℃下水浴30min,反復提取2—3次,直至提取液變為無色為止,冷卻至室溫后用紫外分光光度計測其在665 nm處的OD值,葉綠素a的含量用以下公式計算[17]:

式中,ε為光系數74/cm,l是比色杯的內徑為1 cm。

1.6 藻藍蛋白、別藻藍蛋白和藻紅蛋白的測定

取1 g的葛仙米鮮藻,反復融凍5次,加入磷酸緩沖溶液研磨,然后用細胞破碎儀破碎5次,將其進行離心,轉速為4000 r/min,時間為30min。取上清液,用分光光度計分別測定上清液在562、615和652 nm波長的吸光度A562、A615和A652。計算藻藍蛋白(Pycocyanin,PC)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin,APC)和藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)的含量。根據Siegelman等的公式計算[18]:

1.7 葉綠素熒光參數測定

利用調制脈沖葉綠素熒光儀(PAM-2100,Walz,Effeltrich,Germany)測定葛仙米的葉綠素熒光參數。弱測量光和光化光分別為0.01 μmol/(m2·s)和培養光強,飽和脈沖光為 4000 μmol/(m2·s)(0.8s)。葉綠素的熒光參數PSII的最大光能轉化效率(Maximal photochemical efficiency of PSII,Fv/Fm)、PSII的實際光能轉化效率(Actual photochemical efficiency of PSII,Yield)用以下公式計算[19]:

式中,Fm′和Fm分別是光照和暗適應(15min)后藻的最大熒光水平。F是激發狀態下的實時熒光,調制藍光和遠紅光測量光束分別用于測量Fo和Fo′。

1.8 P-I曲線的測定

光合放氧速率利用YSI生物測氧儀測定,選定5—6個直徑為2—4 mm的葛仙米小球放入反應槽中,在20℃下,測定不同光強下光合放氧速率。通過調節光源和反應槽的距離來控制不同光強。通過P=Pm×tanh(α×I/Pm)+Rd方程對實驗數據進行非線性參數擬合[20-21],其中P是光強為I時的光合速率;Pm為光飽和光合速率[μmol O2mg/(Chl.a·h)];α是光合效率[μmol O2mg/(Chl.a·h)];I為光強[μmol/(m2·s)];Rd為暗呼吸速率[μmol O2mg/(Chl.a·h)]。

1.9 統計分析

應用軟件Excel和Origin 2015(Origin Lab Corp,Northampton,MA,USA)進行數據分析,運用雙因子方差分析(Two-way ANOVA)和DunCan多重比較,分析數據間的差異性。

2 結果

2.1 相對生長速率

如圖 1所示,培養液中P或CO2濃度變化對葛仙米生長均有明顯的影響(P＜0.05)。在大氣CO2濃度下,HP、MP培養的葛仙米相對生長速率比LP分別提高7.63% (P＜0.05)和7.40% (P＜0.05);而在高濃度CO2下,HP、MP培養分別提高10.81% (P＜0.05)和7.00% (P＜0.05)。而僅在MP濃度下,高濃度CO2培養的葛仙米相對生長速率比大氣CO2濃度培養提高9.10% (P＜0.05),在LP和HP濃度下,高濃度CO2對葛仙米生長的效應不顯著(P＞0.05)。雙因子方差分析表明,CO2和P對葛仙米相對生長速率的交互作用不顯著(P＞0.05)。

圖1 葛仙米在不同CO2和P濃度培養下相對生長速率Fig.1 Relative growth rates of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P

2.2 粒徑和數量

如圖 2表示,CO2或P濃度均對葛仙米粒徑和數量具有顯著影響(P＜0.05)。而在大氣CO2濃度培養下(LC),HP濃度培養的小球(1—2 mm)明顯增加(P＜0.05),大球數量減少。但在HC培養下,HP濃度培養下大球(大于4 mm)的顯著增加(P＜0.05)。在相同P濃度時,HC下粒徑大于4 mm的葛仙米小球占比顯著高于LC(P＜0.05)。雙因子方差分析表明CO2和P具有顯著的交互效應(P＜0.05),高濃度CO2培養提升了P濃度對葛仙米球體增大和數量的促進效應。

圖2 不同CO2和P濃度培養下葛仙米球體所占比例(A.1—2 mm,B.＞4 mm)Fig.2 Proportion of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P (A.1—2 mm,B.＞4 mm)

2.3 葉綠素a含量

如圖 3所示,CO2濃度變化對葛仙米葉綠素a含量具有顯著影響(P＜0.05),但P濃度變化的影響不顯著(P＞0.05)。在大氣CO2濃度培養下,LP、MP中葉綠素a含量明顯高于HP (P＜0.05)。而在HC條件下,P濃度變化對葛仙米葉綠素a含量無顯著影響(P＞0.05)。在LP和MP濃度培養下,HC導致葛仙米葉綠素a含量顯著下降(P＜0.05),而在HP下,CO2濃度變化對葉綠素含量并沒有顯著影響(P＞0.05)。雙因子方差分析表明,CO2和磷對葛仙米的葉綠素a含量有顯著的交互作用(P＜0.05),高濃度CO2降低了HP對葉綠素合成的抑制作用。

圖3 葛仙米在不同CO2和P濃度培養下Chl.a含量的變化Fig.3 Changes of Chl.a content in N.sphaeroides under different CO2 and P concentrations

2.4 藻藍蛋白、別藻藍蛋白和藻紅蛋白含量

如表 1所示,CO2濃度變化對葛仙米藻膽蛋白的含量具有顯著的影響 (P＜0.05),但P濃度變化影響并不明顯(P＞0.05)。在相同P濃度培養下,LC培養的葛仙米PC、APC和PE含量分別比HC葛仙米含量高46.62%、34.01%和40.89% (P＜0.05)。雙因子方差分析結果表明,CO2和P對葛仙米的PC、APC和PE含量交互作用不顯著(P＞0.05)。

表1 葛仙米對PC、APC和PE含量的影響Tab.1 PC,APC and PE (mg/g DW) contents of N.sphaeroides under different conditions of CO2 and P concentrations

2.5 葉綠素熒光參數

圖4和圖 5表示不同CO2和P濃度下葛仙米光系統Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)和光系統Ⅱ實際光化學效率(Yield)的變化。CO2或P濃度單因子變化對Fv/Fm無顯著影響(P＞0.05),但CO2濃度變化對Yield具有顯著影響(P＜0.05)。不管LP、MP還是HP,在HC培養下的Yield顯著高于LC培養。雙因子方差分析結果表明CO2和P對葛仙米的Fv/Fm、Yield的交互作用不顯著(P＞0.05)。

圖4 不同CO2和P濃度培養下葛仙米最大光化學效率的變化Fig.4 Changes of maximum photochemical efficiency of N.sphaeroides under different concentrations of CO2 and P concentrations

圖5 不同CO2和P濃度對葛仙米實際光化學效率的影響Fig.5 Effects of different CO2 and P concentrations on the actual photochemical efficiency of N.sphaeroides

2.6 P-I曲線

如圖 6和表 2所示,結果顯示在大氣CO2濃度下(LC),HP的葛仙米Pm值比MP、LP分別高24.89%和27.65%(P＜0.05);在高CO2濃度下,HP比MP、LP培養分別提高18.05%和12.30%(P＜0.05),表明高磷濃度有利于提高葛仙米光飽和光合速率。而在LP和MP濃度下,高濃度CO2培養葛仙米Pm顯著升高(P＜0.05),但HP下影響不顯著(P＞0.05)。雙因子方差分析結果顯示CO2和磷對葛仙米Pm的交互作用不顯著(P＞0.05)。

表2 P-Ⅰ曲線光合參數Tab.2 Photosynthetic parameters of N.sphaeroides grown under different conditions of CO2 and P concentration

圖6 葛仙米在不同CO2和P濃度培養下的P-Ⅰ曲線Fig.6 P-I curves of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P

CO2濃度對葛仙米的Rd有顯著影響(P＜0.05)。在大氣CO2濃度培養下(LC),MP培養的葛仙米Rd顯著低于LP和HP (P＜0.05)。而在高CO2濃度下,MP和HP培養的葛仙米Rd顯著高于LP(P＜0.05);P對葛仙米的Rd也有顯著性影響 (P＜0.05),高CO2濃度培養導致LP的Rd值明顯下降(P＜0.05),而MP和HP則明顯提高(P＜0.05)。雙因子方差分析結果表明CO2和P對葛仙米Rd具有顯著的交互作用(P＜0.05)。

在大氣CO2濃度培養下,P濃度的變化對光合效率沒有明顯影響;但高濃度CO2培養下,P濃度升高導致光合效率明顯升高(P＜0.05),與LP相比,MP和HP培養下α值分別升高40.7%和89.0%。兩因子方差分析結果表明CO2和P對葛仙米α有顯著的交互作用(P＜0.05),高濃度CO2明顯增強了P的效應。

3 討論

CO2是藻類進行光合作用的原料,但在自然環境中CO2濃度遠低于藻類Rubisco的Km,所以有些藻類可以通過形成CO2濃縮機制,以緩解CO2的限制[22]。Riebesell等[23]研究表明海洋浮游植物生長常受CO2供應速率的限制。在藻類高密度培養過程中,無機碳濃度不足也會限制藻細胞的生長,添加無機碳可以促進生物量的增加,但添加CO2的效果明顯優于[24]。本研究結果也顯示高CO2濃度對葛仙米的生長具有明顯促進作用。葛仙米除了能直接通過擴散作用利用CO2外,還具有一定的主動轉運能力[25]。高濃度CO2培養下,藻類光合作用可以通過降低對CO2親和力,增強CO2擴散作用,在葉綠體周圍提高CO2濃度,降低光呼吸;同時可以減少在主動轉運中的能量消耗,將更多能量用于生長所需[22]。在高濃度CO2培養下葛仙米Pm、Fv/Fm和α值的變化也印證了這一點。葛仙米細胞被膠質外鞘包圍,而這些膠質鞘的主要成分是多糖[26],高CO2濃度培養下光合速率的增加有利于有機物質的積累,使葛仙米球體增大和數量增加。但在高濃度CO2培養下葛仙米色素含量(葉綠素和藻膽素)的降低表明高CO2濃度對色素合成具有明顯的抑制作用,這可能與色素合成酶在高濃度CO2下受到了抑制有關。

P元素作為葛仙米主要營養物質,參與葛仙米的生長的多種代謝過程。磷限制會影響光合作用中的卡爾文循環和ATP的合成,同時P也參與細胞內能量轉換和遺傳信息的傳遞,調節酶活性,進而影響光合作用。Gao等[27]研究發現磷加富能增強中肋骨條藻的主動轉運能力促進無機碳的獲取,進而增強光合速率。而Chen等[13]研究也反映了提高磷濃度有利于促進葛仙米生長和光合速率,我們的研究結果也與之相一致。Gantt等[28]研究表明藻膽蛋白作為藻類捕獲光能天線系統的重要成分,其主要功能是捕獲光能,并將光能以95%以上的效率傳遞給光系Ⅱ(PSⅡ),但本研究顯示磷濃度變化對色素含量(葉綠素a和藻膽素)并沒有明顯影響,表明高磷培養下葛仙米光合速率的增加并不是通過增加光能的捕獲,而是可能通過提高光能的利用效率來實現,同時高磷濃度可能通過增加ATP的合成提升無機碳的主動轉運能力,增加在Rubisco周圍CO2濃度,導致光合速率增加,促進葛仙米生長。

CO2或P濃度單因子變化均可以影響葛仙米的生長和光合作用,但兩者的交互作用呈現與單獨作用不同的效應。如CO2×P對藻膽蛋白含量、Fv/Fm和Yield等并沒有顯著的交互效應,表明CO2和P濃度變化對藻膽素合成、最大光化學效率和實際光化學效率的效應僅是獨立作用。Xu等[29]在大型海藻(Sargassum muticum)的研究中表明在大氣CO2濃度和高磷培養葉綠素含量明顯增加,但在高濃度CO2培養下,高磷對葉綠素含量并沒有明顯影響。我們的研究顯示在大氣CO2濃度培養下,磷濃度升高導致葉綠素a含量的下降,但高濃度下則未見此現象,表明高濃度CO2培養緩解了高磷濃度對葉綠素a合成的抑制效應,這可能與高濃度CO2培養下能量的分配相關。本研究結果也顯示大氣CO2濃度培養下P濃度增加對光合效率的影響并不明顯,但在高濃度CO2培養下增強了磷對光合效率的效應,兩者存在明顯的交互作用,表明高濃度CO2和磷濃度對光合效率的提高具有明顯的協同作用,這與高濃度CO2和高磷濃度具有較高的相對生長速率、較多的粒徑較大球體數量相一致,這也可能與高CO2濃度下和高磷濃度下能提供更多的ATP相關。

總之,在葛仙米大量培養中,添加高濃度CO2有利于葛仙米的生長,同時將BG110培養液中磷濃度加倍,兩者的協同效應更有利于促進葛仙米球體的增大和較大球體數量的增加。本研究為葛仙米大量培養過程中CO2和磷的添加提供了生理學理論基礎。