雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲的毒性效應(yīng)

潘厚軍 鄧美玲 古欣婷 鄭巧銀 劉雨果

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510380;2.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,東莞 523808)

青蒿素是中國科學(xué)家從傳統(tǒng)中藥青蒿中分離得到的倍半萜內(nèi)酯類化合物的一種,是抗瘧疾特效藥物[1]。雙氫青蒿素是青蒿素在體內(nèi)的有效活性代謝產(chǎn)物之一,在體外可由四氫硼鈉還原青蒿素而得到。雙氫青蒿素不僅能有效防治瘧原蟲[2],對其他寄生蟲同樣具有較好的殺滅效果[3—8]。很多寄生蟲病分布范圍廣,對人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大危害。如車輪蟲和多子小瓜蟲是引起水生動(dòng)物患病和死亡的主要寄生蟲,對水生生態(tài)和養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損害[8];血吸蟲能引起人獸共患的血吸蟲病,對該病的防治在公共衛(wèi)生方面的重要性僅次于瘧疾[9]。由于寄生蟲離體培養(yǎng)困難,并且寄生蟲材料來源難以穩(wěn)定獲得,因此采用與寄生蟲分類地位相近的替代模式生物,對于研究青蒿素類藥物抗寄生蟲的作用機(jī)制具有重要作用。

嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)隸屬于原生動(dòng)物門纖毛亞門,可在淡水環(huán)境中營自由生活。嗜熱四膜蟲是重要的單細(xì)胞真核模式生物,遺傳背景清楚且基因組序列的數(shù)據(jù)庫完備,以其為對象在細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域取得了一系列成果[10,11]。此外嗜熱四膜蟲能在無菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)方法簡單,個(gè)體小且繁殖周期短。大量研究表明,嗜熱四膜蟲是研究藥物[12]、有機(jī)化合物[13]和無機(jī)物[14]等外源化學(xué)物質(zhì)潛在毒性的良好模式生物。

線粒體是機(jī)體能量代謝的中心,還參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)[15]。線粒體介導(dǎo)的途徑在青蒿素類藥物誘導(dǎo)瘧原蟲細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用[2]。線粒體通路途徑可通過改變線粒體膜通透性,引起線粒體膜電位降低和活性氧類增加,促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡[16,17]。本文利用能體外培養(yǎng)的嗜熱四膜蟲為試驗(yàn)對象,在嗜熱四膜蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中定量加入不同劑量的雙氫青蒿素,研究DHA對細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)行為等生理方面和細(xì)胞增殖、線粒體功能、氧化還原水平等生化方面的影響,探討DHA對嗜熱四膜蟲的毒性作用,為評估青蒿素類藥物在抗蟲方面潛在的藥用價(jià)值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

嗜熱四膜蟲(B2086.2株由美國康奈爾大學(xué)贈(zèng)送)蟲種以5% 的體積分?jǐn)?shù)接種于裝有5 mL Neff培養(yǎng)液(0.25% 蛋白胨、0.25% 酵母提取物、0.5%葡萄糖和 9 g/L的FeCl3母液按0.1% 體積比加入)的試管中,于30℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)48h后,將處于對數(shù)生長期時(shí)的嗜熱四膜蟲蟲液轉(zhuǎn)移擴(kuò)大培養(yǎng)。

雙氫青蒿素的配制:0.1 g DHA(99.9%,中國食品藥品檢定研究院)用少量二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成0.2 mol/L DHA儲(chǔ)備液,使用時(shí)用適量培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2 CCK8法檢測細(xì)胞增殖活力

采用CCK8法測定雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響。移取對數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲按1×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于10 mL新鮮培養(yǎng)液中。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L),陰性對照組(0.01% DMSO)和空白對照組(無蟲體的培養(yǎng)液),在30℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24h、48h和72h。吸取100 μL至96孔板,參考CCK8試劑盒(CK04-500T,東仁化學(xué)科技上海有限公司)說明書所述方法,用酶標(biāo)儀(800TS,美國伯騰儀器有限公司)于450 nm處測定吸光度(A)值。細(xì)胞增殖活力(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100%(其中A1、A2和A0分別為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白組的A值)。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 嗜熱四膜蟲細(xì)胞形態(tài)觀察

移取對數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲按1×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于10 mL新鮮培養(yǎng)液中。設(shè)置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L)和對照組(0.01% DMSO)。于30℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)48h。各組分別取200 μL依次加入24孔板中,倒置顯微鏡(Ti-S,日本Nikon公司)下觀察細(xì)胞數(shù)目,形態(tài)和運(yùn)動(dòng)狀況。為了進(jìn)一步觀察細(xì)胞凋亡特征,于培養(yǎng)48h 后,3200 r/min離心5min收集細(xì)胞,棄上清。加沉淀2—3倍體積的Hoechst 33258染色液(C1017,上海碧云天生物技術(shù)有限公司),室溫避光培養(yǎng)20min,3200 r/min離心5min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4)洗2次,取20 μL細(xì)胞懸液滴在載玻片上,加入抗熒光淬滅封片液(P0126,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。熒光顯微鏡(X73,日本Olympus公司)下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.4 線粒體膜電位分析

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組同1.3。取DHA處理48h后的細(xì)胞,經(jīng)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),收集4×104個(gè)細(xì)胞。按 JC-1試劑盒(C2006,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)使用說明書要求操作,配置JC-1工作液及JC-1緩沖液(使用前稀釋至1×),四膜蟲細(xì)胞置于JC-1工作液,37℃ 染色20min,離心取上清,加JC-1緩沖液重懸離心,重復(fù)洗滌2次后用適量JC-1緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ,美國BD公司)檢測,分別采集紅色熒光(激發(fā)波長525 nm,發(fā)射波長585 nm)和綠色熒光(激發(fā)波長490 nm,發(fā)射波長 530 nm)下的圖像。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量,以紅/綠熒光強(qiáng)度比值表示線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 嗜熱四膜蟲抗氧化酶活力

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組同1.3。取DHA處理48h后的細(xì)胞,以3200 r/min離心5min收集細(xì)胞,棄上清。用生理鹽水洗2次后加入一定量的PBS使細(xì)胞重新懸浮,經(jīng)液氮反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解。將細(xì)胞懸液在4℃ 3200 r/min離心5min,取上清液待測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和琥珀酸脫氫酶(SDH)測定均采用南京建成生物工程研究所研制試劑盒,按照相關(guān)說明書操作經(jīng)分光光度計(jì)測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。單因素方差分析(One way ANOVA)檢驗(yàn)組間是否存在顯著性差異,如果存在顯著性差異,通過Tukey分析法進(jìn)行多重比較,顯著性差異水平采用P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響

DHA作用嗜熱四膜蟲24h、48h和72h后,采用CCK-8法檢測各濃度組、各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況(圖1)。隨著濃度增加,嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖活力下降,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24h下,40與80 μmol/L組,80與160 μmol/L組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在48h和72h下各時(shí)間點(diǎn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表現(xiàn)為增殖活力與濃度呈負(fù)相關(guān)。在相同DHA作用濃度下,細(xì)胞增殖隨著時(shí)間增加表現(xiàn)為逐漸降低,72h時(shí)細(xì)胞增殖活力最低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取DHA暴露48h作為時(shí)間樣點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of DHA on the proliferation of Tetrahymena thermophila

2.2 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲形態(tài)及運(yùn)動(dòng)的影響

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見圖 2,對照組嗜熱四膜蟲細(xì)胞呈橢圓長梨狀,細(xì)胞數(shù)目多,活動(dòng)速度快。DHA作用下各濃度組嗜熱四膜蟲形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞皺縮變圓,胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯;同時(shí)隨著濃度增大,細(xì)胞生長明顯受到抑制,活動(dòng)速度逐漸減慢。與對照組比較,160和320 μmol/L濃度組DHA處理細(xì)胞可見數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)細(xì)胞破裂和異常細(xì)胞形態(tài)。

圖2 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲形態(tài)的影響 (比例尺=20 μm)Fig.2 The effect of dihydroartemisinin on morphology of Tetrahymena thermophila (Scale bar=20 μm)

Hoechst 33258核染色結(jié)果見圖 3。與對照組比較,40和80 μmol/L濃度組DHA處理后細(xì)胞核形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化。160和320 μmol/L濃度組DHA處理后,細(xì)胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光,且胞核固縮變小,并出現(xiàn)凋亡小體(圖3箭頭指示)。

2.3 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲線粒體膜電位水平的影響

圖4中的細(xì)胞散點(diǎn)圖所示,對照組細(xì)胞集中在左下區(qū),紅色熒光強(qiáng),線粒體膜電位高。隨著DHA濃度的增加,綠色熒光強(qiáng)度增加,右下區(qū)細(xì)胞逐漸增多。對照組與40、80、160和320 μmol/L DHA實(shí)驗(yàn)組的紅/綠熒光比值分別為(1.13±0.28)、(0.93±0.13)、(0.93±0.27)、(0.14±0.18)和(0.12±0.31)。與對照組相比,160和320 μmol/L濃度組DHA處理后細(xì)胞的紅/綠熒光比值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說明在一定濃度下雙氫青蒿素可使嗜熱四膜蟲細(xì)胞線粒體膜電位下降。

圖4 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 The effect of dihydroartemisinin on mitochondrial membrane potential of Tetrahymena thermophila

2.4 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲酶活力的影響

不同濃度DHA作用嗜熱四膜蟲后,其抗氧化酶活力和SDH水平見表 1。在40、80和160 μmol/L DHA作用下,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px、GST和CAT活性明顯高于對照組(P＜0.05),320 μmol/L DHA作用下細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-PX活性明顯低于對照組(P＜0.05),GST和CAT活性與對照組相比無顯著性差異。隨著DHA濃度增加,抗氧化酶活力呈先升高后降低的趨勢。DHA作用下各濃度組與對照組相比,琥珀酸脫氫酶活力均顯著降低(P＜0.05)。

表1 雙氫青蒿素作用對嗜熱四膜蟲SOD、GSH-PX、GST、CAT和SDH活力的影響Tab.1 The effect of dihydroartemisinin on enzyme activities in Tetrahymena thermophila (mean±SD,n=3;U/mg Prot)

3 討論

DHA 是青蒿素的衍生物,最先用于治療瘧疾,同時(shí)也具有抗腫瘤、抑菌殺蟲和免疫調(diào)節(jié)的功用。關(guān)于DHA抗寄生蟲作用的研究,發(fā)現(xiàn)DHA通過破壞原蟲表膜-線粒體系統(tǒng)[3]來抑制伯氏瘧原蟲的生長;通過對毛蟲滋養(yǎng)體的蛋白質(zhì)及細(xì)胞骨架的損傷作用,來抑制藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的生長[4];此外DHA 能破壞卡氏肺孢子蟲滋養(yǎng)體和包囊[5]、蟲膜系結(jié)構(gòu)[6]而起到殺蟲作用。伴隨抗寄生蟲藥物耐藥性挑戰(zhàn),雙氫青蒿素有望成為抗寄生蟲新藥,但其殺蟲機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。因此我們采用能體外培養(yǎng)的嗜熱四膜蟲來研究雙氫青蒿素的抗蟲作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先觀察雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲增殖和形態(tài)的影響,結(jié)果顯示與對照組相比,DHA作用下細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞形態(tài)改變且運(yùn)動(dòng)速度減慢。研究表明青蒿琥脂、雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲生長代謝有抑制作用,但雙氫青蒿素的抑制作用強(qiáng)于青蒿琥脂[18],這可能與兩者的構(gòu)效不同有關(guān)。

當(dāng)生物體暴露于外界毒物時(shí),抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)構(gòu)成機(jī)體的第一道防線,抗氧化酶活力的改變可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。關(guān)于外源化學(xué)物質(zhì)對嗜熱四膜蟲生物脅迫作用的研究顯示,H2O2處理后細(xì)胞線粒體膜電位喪失,發(fā)生凋亡樣死亡[19]。有機(jī)紫外防曬劑[20]和納米材料[21]均可誘導(dǎo)嗜熱四膜蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)如SOD和GST等活力降低。在本研究中,DHA在40、80和160 μmol/L濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶升高,說明嗜熱四膜蟲表現(xiàn)出氧化應(yīng)激。隨著DHA濃度升高至320 μmol/L,抗氧化酶水平降低。推測中低濃度DHA暴露下機(jī)體抗氧化防御酶活性增強(qiáng)以減輕DHA對細(xì)胞造成的氧化脅迫,而高濃度DHA暴露下細(xì)胞內(nèi)氧化損傷加重導(dǎo)致細(xì)胞活力降低,進(jìn)而破壞抗氧化酶導(dǎo)致酶水平降低。Ye等[12]研究發(fā)現(xiàn),高濃度鉤吻素子(中藥斷腸草中的活性成分)作用嗜熱四膜蟲可引起氧化應(yīng)激和凋亡,低濃度下脅迫作用不明顯。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定差異,不同化學(xué)物質(zhì)對嗜熱四膜蟲的毒性大小有所區(qū)別,因此細(xì)胞對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性響應(yīng)不同。

線粒體膜電位的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能[22]。有研究表明青蒿素在快速殺滅寄生蟲過程中線粒體膜電位下降是主要生理事件,而膜電位下降又與氧化應(yīng)激催化生成的活性氧(ROS)有關(guān)[23]。琥珀酸脫氫酶參與線粒體能量代謝,是反映線粒體功能的標(biāo)志酶[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,一定濃度的DHA(160和320 μmol/L)暴露可降低嗜熱四膜蟲線粒體膜電位和琥珀酸脫氫酶活力(P＜0.05),這表明DHA暴露可造成線粒體功能損傷。在神經(jīng)元細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位下降是蒿甲醚引起神經(jīng)毒性的重要環(huán)節(jié)[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究有相似之處,青蒿素類藥物對細(xì)胞的毒性作用可能與線粒體損傷有關(guān)[26]。結(jié)合Hoechst染色結(jié)果,包括細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮和染色體凝集等典型凋亡形態(tài)學(xué)改變,故推測DHA暴露導(dǎo)致氧化應(yīng)激,引起活性氧過度堆積,造成線粒體損傷,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而考慮到線粒體通路產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞傳導(dǎo)通路和級聯(lián)反應(yīng),雙氫青蒿素抗嗜熱四膜蟲的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究現(xiàn)有結(jié)果表明DHA對嗜熱四膜蟲具有毒性效應(yīng),氧化應(yīng)激和線粒體損傷可能是毒性作用途徑。