鳶尾甲苷B對氧糖剝奪/復氧損傷PC12細胞的神經保護作用

周 密，陸 瑤，劉惠霞，陳明惠 ，鄭梅竹

(1.長春師范大學生命科學學院，吉林 長春 130032；2.長春師范大學中心實驗室，吉林 長春 130032)

腦卒中(Stroke)是一種嚴重的神經退行性疾病，有較高的發病率、致殘率和致死率[1-2]。特征是氧氣供應不足和血流恢復受阻，腦內神經元因缺血再灌注損傷而突然死亡。腦卒中與氧化應激、Ca2+超載、細胞凋亡、炎癥反應、神經元興奮毒性和能量代謝失衡等多種病理過程緊密相關[3-6]。這些情況相互作用和重疊，形成惡性循環，導致不可逆轉的持續性神經功能障礙。中風發生時，腦內的血液供應出現阻礙或出血，導致大腦功能迅速喪失，造成腦內神經元的不可逆轉性損傷。

PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤，具有類似神經細胞的特性，被廣泛應用于體外神經系統損傷研究[7]。連二亞硫酸鈉是一種氧結合劑，加入液體培養基中可以短時間內結合培養基中的氧氣，造成細胞低張性缺氧，且操作簡單、起效快，安全穩定，能夠準確反映體內細胞的缺血缺氧損傷情況[8]。到目前為止，腦卒中的治療策略仍是有限的。本文利用PC12細胞建立細胞模型，采用化學性缺氧，在培養基中加入連二亞硫酸鈉(Na2S2O4),旨在探討天然產物射干中鳶尾甲苷B (Iristectorin B)對氧糖剝奪(OGD)以及復氧誘導的PC12細胞損傷的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 藥品

PC12細胞株(中國科學院上海細胞生物研究所)；鳶尾甲苷B(上海源葉生物科技有限公司)；依達拉奉(濟南中科化工有限公司)；胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)(Sigma公司)。

1.1.2 試劑

DMSO(Sigma公司)；DMEM培養基(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco公司)；LDH檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、Ca2+檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.1.3 主要儀器

NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(日本Nikon)；EXL808型酶標儀多功能細胞讀板器(美國伯騰)； Olympus BX51光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 PC12細胞培養

PC12細胞培養于含10%胎牛血清、含1%的青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養基中,5% CO2、37℃培養箱內培養約3～4 d。待PC12細胞生長到貼壁約70%～80%時用0.25 %的胰蛋白酶進行消化傳代。將其制成細胞計數約1×105個/L的細胞懸液后，以每孔100 μL為準接種于96孔板, 繼續于5% CO2、37℃條件下培養1～2 d ,待細胞密度達到80%～90%即可用于后續實驗。

1.3 氧糖剝奪/復氧(OGD/R)離體腦卒中模型的建立及實驗分組

為探究天然異黃酮鳶尾甲苷B對OGD/R處理損傷后PC12的保護作用，將上述處理后的PC12細胞分為：模型組(M)：加入含10 mmol/L Na2S2O4的無糖EBSS溶液100 μL，作用2 h，換為正常培養基復氧，繼續培養24 h構成誘導OGD/R損傷模型，以模擬缺血性腦損傷。對照組(C)：不經OGD/R損傷處理。藥物組(分別為處理D、Z、G)：在OGD/R的基礎上分別加含鳶尾甲苷B 6.25、12.5、25 μg/mL的正常培養液復氧 24 h。陽性組(Y)：在OGD/R的基礎上加10 mmol/kg依達拉奉作為陽性對照。

1.4 評價指標及方法

1.4.1 形態學觀察

加入處理因素，繼續37℃孵育48 h后, 在倒置顯微鏡下觀察上述處理組的PC12細胞形態學改變情況。

1.4.2 MTT法測細胞活性

藥物作用結束后，在避光條件下，每孔加入10 μL質量濃度為5 g/L的MTT于96孔細胞培養板中，5% CO2、37℃條件下繼續孵育3～4 h后棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，低速振蕩10～15 min后，用酶標儀測定490 nm處各孔的吸光度，實驗重復3次，數據做統計分析。

1.4.3 PC12細胞中Ca2+含量檢測

藥物作用結束后，用裝載2.5 μmol/L Fluo-3AM熒光探針的培養液與細胞在5% CO2、37℃條件下繼續孵育1 h，經過適當洗滌后，利用熒光顯微鏡觀察鈣離子產生的熒光，并用酶標儀檢測，波長分別為488 nm和530 nm。同時，為排除細胞密度的影響，后續做MTT使細胞密度歸一化后，計算最終PC12細胞內Ca2+含量。

其中，H為Ca2+含量，A為每孔鈣離子檢測值，O為相應孔MTT吸光度，B為每一個處理組MTT平均值。

1.4.4 PC12細胞中LDH釋放量檢測

藥物作用結束后，根據LDH測定試劑盒說明書進行PC12細胞內釋放量測定，依據LDH釋放率的高低來評價PC12細胞的損傷程度。

其中，D為LDH釋放率(%)，M為樣品上清液LDH活性，C為細胞最大LDH活性。

1.4.5 PC12細胞中ROS水平檢測

藥物作用結束后，用裝載10 μmol/L DCFH-DA探針的無血清培養液與細胞在5% CO2、37℃條件下繼續孵育20 min，經過無血清培養液適當洗滌后,借助酶標儀對PC12細胞內ROS水平進行檢測，計算方式與上述Ca2+含量的計算方式相同。

1.4.6 細胞凋亡檢測

藥物作用結束后，利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(其中Annexin V-FITC為異硫氰酸熒光素標記的磷脂結合蛋白，PI為碘化丙啶)并通過流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡情況。

1.5 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，采用t檢驗確定顯著性水平，若P<0.05，則具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 PC12細胞形態學變化

PC12細胞經Na2S2O4處理2 h后，于倒置顯微鏡下可見模型組的細胞損傷，與對照組相比細胞突觸減少，形態固縮成圓形，細胞數量顯著降低(圖1 a,b)。當鳶尾甲苷B或者依達拉奉存在時, 細胞恢復原有形態,細胞損傷有所改善，活細胞數目增多(圖1 c,d,e,f)。

(a)處理C (b)處理M (c)處理Y

(d)處理D (e)處理Z (f)處理G圖1 各組PC12細胞形態學變化

2.2 鳶尾甲苷B對細胞存活率影響

如圖2所示，模型組PC12細胞存活率明顯低于正常細胞組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組細胞存活率有明顯提高(P<0.01)。圖中,**表示與正常組細胞比較，P<0.01;#表示與模型組比較，P<0.05;##表示與模型組比較，P<0.01。下同。

2.3 鳶尾甲苷B對細胞內Ca2+含量影響

如圖3所示，模型組PC12細胞內Ca2+含量明顯高于正常細胞組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 25 μg/mL 劑量組Ca2+含量有所降低(P<0.01)。

圖2 鳶尾甲苷B對PC12細胞存活率的影響 圖3 鳶尾甲苷B對PC12細胞內Ca2+ 含量的影響

2.4 鳶尾甲苷B對細胞內LDH釋放量影響

如圖4結果顯示，模型組LDH釋放量明顯高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組LDH釋放量明顯降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

2.5 鳶尾甲苷B對細胞內ROS水平影響

如圖5結果顯示，模型組ROS水平明顯高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組ROS水平明顯降低(P<0.01)。

圖4 鳶尾甲苷B對PC12細胞內LDH釋放 圖5 鳶尾甲苷B對PC12細胞內ROS水平的影響

2.6 鳶尾甲苷B對細胞凋亡影響

如圖6流式細胞凋亡圖和圖7結果顯示，對照組的細胞凋亡率為3.6%，模型組的細胞凋亡率為 22.17%，經過OGD/R后，PC12細胞凋亡比例明顯高于對照組。鳶尾甲苷B 6.25 μg/mL處理組細胞凋亡率為14.89%，12.5 μg/mL處理組細胞凋亡率為9.5%，25 μg/mL處理組細胞凋亡率為7.77%，依達拉奉陽性處理組細胞凋亡率為6.35%，藥物組和陽性組與上述兩組相比細胞凋亡率有顯著降低。

(a)處理C (b)處理M (c)處理Y

(d)處理D (e)處理Z (f)處理G圖6 不同濃度鳶尾甲苷B作用后的流式細胞凋亡圖

圖7 不同濃度鳶尾甲苷B對PC12細胞凋亡的影響

3 討論

腦卒中是一種嚴重危害人體健康的腦血管疾病，特征是發病率高、發病快、容易復發、高度致殘、嚴重時致死，是全球范圍內重要的致死性疾病之一[9]。腦卒中發生時，腦部血管會突然破裂造成出血或者血管內形成血栓阻塞血液流動，從而引起腦內神經元損傷，隨后的缺血/再灌注(I/R)還將引發一系列的病理事件[10]，最終導致對腦組織和其他器官的不可逆轉損傷。卒中屬于難治愈性的腦部疾病，患者一般需要長期服用藥物來控制病情，然而目前常用的腦保護藥物主要為合成藥物，如鈣拮抗劑、自由基清除劑等[11]，然而長期服用合成類藥物可能對患者的代謝產生影響。天然藥物中有效成分的藥性相對平和，可能產生的副作用沒有很明顯，更適合患者長期服用。因此，迫切需要開發對腦卒中有神經保護作用的天然藥物。

天然藥物射干[12]中主要有效成分為異黃酮類，其在預防及治療心腦血管疾病方面具有一定重要作用[13]。其中鳶尾甲苷B(Iristectorin B)是射干中的主要活性成分之一，被認為具有許多生物活性。已有研究表明，鳶尾甲苷B具有降低血脂、血糖，抗氧化、抗動脈粥樣硬化、提高免疫功能，增強抗感染能力等作用[14]，其在抗腦卒中具有潛在的研究價值，鳶尾甲苷B對腦卒中保護作用有待進一步研究。

在研究腦卒中離體實驗中，多用PC12細胞建立細胞模型。PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤，由于與中腦多巴胺神經元的共同特征，具有類似神經細胞的特性，被廣泛應用于體外神經系統損傷研究[15]。腦卒中發生會引起大量神經元凋亡，Ca2+超載，LDH、ROS釋放量增加等情況都與細胞凋亡[16]過程息息相關，造成腦細胞功能障礙及形態學破壞。研究結果表明，鳶尾甲苷B能顯著提高細胞存活率，減少細胞凋亡數目，降低細胞中Ca2+、LDH、ROS的表達水平。目前有關鳶尾甲苷B抗腦卒中及其機制的研究還未見報道，本研究結果也為進一步研究天然藥物黃酮類化合物的抗腦卒中機制以及發生發展提供了新的參考價值。