大麻二酚緩解高脂飲食老齡小鼠肝臟脂肪變性的實驗研究

夏文秀，吳方麗，侯 穎，張廣維，黨瑞杰，李 琳

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)是一種以肝臟脂肪代謝紊亂及脂肪過度沉積為主要特征的代謝應激性肝損傷，是代謝綜合征在肝臟的主要表現。全世界NAFLD患病率高達25%。脂肪變性是NAFLD的初始階段，與胰島素抵抗和血脂異常顯著相關，亦有可能發展為不可逆性肝硬化和肝癌。采用藥物緩解肝臟脂肪變性并探討相關分子機制對于防治NAFLD具有非常重要的臨床意義。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是大麻素類天然化合物，其完全不具有精神活性。大麻素能調節脂質和葡萄糖的代謝，CBD能緩解肝纖維化和肝臟炎癥，還能減輕酒精誘導脂肪肝病中的肝臟損傷。但CBD對NAFLD是否具有保護作用及其作用機制仍不清楚。老齡鼠更容易發生胰島素抵抗。因此，本研究以老齡小鼠為模型，探討CBD對高脂飲食老齡小鼠肝臟脂肪變性的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器 15月齡雄性C57BL/6J小鼠(維通利華，北京)；CBD (CATO， 美國)；抗腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)抗體(#5832；CST，美國)、磷酸化(p)-AMPK抗體(#2535；CST， 美國)；乙酰輔酶A羧化酶(ACC)抗體(Ab45174；Abcam，英國)、p-ACC抗體(Ab68191；Abcam，英國)；β-actin抗體(BM0627；博士德，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德，中國)；qRT-PCR試劑盒(Takara，日本)；蛋白電轉、電泳設備(Bio-Rad， 美國)；實時熒光定量PCR儀(FTC-3000P，Funglyn Biotech，加拿大)；便攜式血糖儀及試紙(One Touch，美國)；自動生化分析儀(日立，日本)；酶聯免疫吸附試驗試劑盒(R&D Systems， 美國)；比色分析試劑盒(南京建成，中國)；顯微鏡(奧林巴斯， 日本)。

1.2 動物模型建立及分組 30只15月齡雄性C57BL/6J小鼠在中部戰區總醫院實驗動物科適應性飼養2周后，隨機分為三組：正常飲食組(NC組；普通飼料；=10)、高脂飲食組(HFD組；60%高脂飼料；=10)和CBD治療組[CBD組；60%高脂飼料，腹腔注射CBD(10 mg/kg， 每周3次)；=10]。12周后，所有小鼠禁食過夜并實施安樂死后采集樣本。

1.3 血清中相關指標測定 生化分析儀測定血清中葡萄糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定血清中胰島素水平。比色分析試劑盒測定游離脂肪酸(FFA)。

1.4 組織學檢測 小鼠肝臟組織標本于4%多聚甲醛中固定。使用冷凍切片機將組織切成5 μm厚的切片，油紅O染色，在顯微鏡下觀察肝臟的組織學變化。

1.5 葡萄糖耐量實驗(IPGTT)和胰島素耐量實驗(ITT) 葡萄糖耐量實驗前，三組小鼠禁食15 h，腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)。胰島素耐量實驗前，將三組小鼠禁食5 h，腹腔注射胰島素(0.75 U/kg)。分別在葡萄糖及胰島素注射后15、30、 60 、90、120 min，尾靜脈采血法及便攜式血糖儀測定小鼠的血糖濃度，繪制IPGTT及ITT曲線并計算曲線下面積(AUC)。

1.6 相關基因mRNA檢測 取小鼠肝臟組織，液氮速凍后研磨并使用TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度后定量1 μg RNA為模板，反轉錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR儀檢測脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP1c)、ApoE、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚堿轉移酶1a(CPT1a)的mRNA表達；PCR反應條件：95 ℃ 3 min；40個循環： 95 ℃持續 15 s， 60 ℃持續15 s，72 ℃持續 15 s。相關引物均由上海生工合成(表1)。

1.7 Western blot檢測 取小鼠肝臟組織，液氮速凍后研磨并使用RIPA裂解液提取組織蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后定量30 μg蛋白。隨后進行蛋白電泳及轉膜，結束后將PVDF膜在室溫封閉1 h，接下來按照1∶1000的濃度配置一抗：AMPK、p-AMPK、ACC和p-ACC，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF膜在二抗中室溫孵育1 h，使用TBST洗膜3次后使用顯影劑觀察條帶上蛋白的表達情況。具體實驗步驟參照文獻[9]。

2 結 果

2.1 CBD對老齡小鼠代謝特征的影響 HFD組的血糖水平、胰島素水平、TG、TC、FFA、ALT和AST的含量相比于NC組小鼠均顯著升高(<0.05)，CBD組的上述代謝相關參數的水平顯著減低，提示CBD能改善HFD小鼠的糖脂代謝紊亂(表2)。

2.2 CBD對老齡小鼠肝臟脂肪變性的影響 油紅O染色發現，與NC組小鼠比較，HFD組小鼠肝臟細胞內存在明顯脂滴，CBD組紅染脂滴數量明顯變少，提示CBD可以減輕HFD小鼠的肝臟脂肪變性(圖 1)。

2.3 CBD對老齡小鼠葡萄糖處理能力的影響 IPGTT和ITT實驗結果顯示，與NC組小鼠相比，HFD組小鼠葡萄糖和胰島素耐量受損，CBD干預能夠部分恢復高脂飲食小鼠的葡萄糖處理能力(圖2)。

2.4 CBD調節老齡小鼠脂質代謝相關基因mRNA表達 qRT-PCR檢測脂代謝相關基因的mRNA表達水平(表3)，與NC組小鼠相比，HFD組小鼠中脂肪生成相關基因：FAS和 SREBP1c表達水平均顯著上調，CBD干預顯著降低了FAS和SREBP1c的mRNA表達水平。HFD組小鼠參與脂質分泌的基因ApoE及與脂肪氧化相關的PPARα及CPT1a的表達受到抑制，CBD能增加這些基因的mRNA表達水平。

2.5 CBD激活AMPK/ACC信號通路 Western blot檢測三組老齡小鼠中p-AMPK及p-ACC蛋白的表達情況(圖3)。在HFD組小鼠中，p-AMPK及p-ACC蛋白表達水平顯著降低(<0.05)。CBD干預后，與HFD組相比，p-AMPK及p-ACC蛋白的表達水平顯著升高(<0.05)。

3 討 論

隨著我國人民生活水平的顯著提高，NAFLD的發病率逐年增高，已取代慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。肝臟脂肪變性是NAFLD的初始病理階段，尚無明確有效的治療藥物。本研究發現，CBD可以顯著改善老齡小鼠中糖脂代謝相關參數，降低胰島素敏感性，降低肝細胞中的脂質積累，進而減輕小鼠肝臟脂肪變性。同時，CBD改善脂質代謝相關mRNA的表達水平，提高AMPK和ACC的磷酸化水平，表明CBD對老齡小鼠肝臟脂肪變性的發揮，AMPK/ACC信號通路參與了這一過程。

糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要臨床表現，與胰島素抵抗、血脂異常顯著相關。在本研究中，我們檢測了不同組間小鼠糖脂代謝相關參數的變化，結果表明，CBD顯著降低了HFD老齡小鼠的血糖水平、胰島素含量、TG、TC、FFA、ALT及AST的水平。同時，CBD干預提高了HFD老齡小鼠對葡萄糖的處理能力，改善胰島素抵抗。

脂代謝涉及脂質合成、分泌和氧化分解等過程。在脂質合成代謝中， SREBP-1c是調節與肝臟脂肪合成相關酶的活性和表達的關鍵轉錄因子，其能促進脂肪酸合成代謝。FAS是體內合成內源性脂肪酸的關鍵酶之一， 能被SREBP-1c激活，將多余的能量以三酰甘油的形式儲存在脂肪組織中，進而促進肝臟脂肪合成。在脂質分解代謝中，PPARα則能通過激活脂肪氧化基因的表達促進脂肪酸氧化，從而促進脂肪的降解，其表達的異常與許多脂代謝性疾病有關。CPT1a 能與長鏈脂酰輔酶A合成脂酰肉堿，并將其轉運至線粒體而促進其氧化分解。 ApoE是血漿中重要的載脂蛋白，具有轉運膽固醇，調節脂類代謝的作用。在本實驗中，qRT-PCR顯示HFD老齡小鼠中SREBP-1c及FAS的表達水平顯著升高，而PPARα、CPT1a及ApoE的轉錄水平被顯著抑制，表明經高脂飲食喂養的老齡小鼠，脂肪合成被活化而脂肪分解代謝被顯著抑制。CBD干預能顯著降低SREBP-1c及FAS，并提高PARPα、CPT1a及ApoE的mRNA表達水平，證明在HFD老齡小鼠中，CBD的干預能抑制脂質合成代謝并促進脂質分解代謝相關基因的表達。

ACC也是脂肪酸合成的關鍵酶，能被SREBP-1c激活，促進脂質合成并抑制脂肪酸氧化。AMPK信號通路是脂質代謝的重要通路， AMPK在調控ACC活性中具有關鍵作用。AMPK經磷酸化激活后，進一步磷酸化ACC，而ACC被AMPK磷酸化后失去活性，進而促進脂質的線粒體氧化，減少脂質的沉積。本研究通過Western blot實驗觀察到，在HFD小鼠中，APMK和ACC的磷酸化水平受到抑制，而CBD干預促進了p-AMPK和p-ACC的表達水平，表明CBD能激活AMPK并使下游的ACC失去活性，進而減輕高脂喂養的小鼠的肝臟脂肪變性。這些結果表明，APMK/ACC信號通路參與了CBD干預改善HFD小鼠的肝脂肪變性的過程。

綜上所述，CBD能改善高脂飲食小鼠中糖脂代謝相關參數的紊亂，減輕高脂飲食的胰島素抵抗和肝臟脂肪變性，對APMK/ACC通路的激活作用可能是其發揮肝臟保護作用的潛在機制。本研究仍具有一定的局限性。CBD主要通過CBD受體CB1和CB2發揮胞內作用，但本研究未探討CBD受體在CBD緩解高脂飲食老齡小鼠肝臟脂肪變性中的作用，未采用AMPK抑制劑反證AMPK/ACC信號通路的作用，課題組將在下一步研究中繼續上述工作。