銀耳多糖提取工藝的響應面法優化及抗氧化和保濕性研究

安星亮，趙永亮，王歡，姚啟悅，李飛寰

（河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450001）

銀耳（Tremella fuciformis）又稱白木耳、雪耳，為擔子菌門真菌銀耳的子實體，是一種藥食兼用真菌，享有“菌中之冠”的美譽[1]。銀耳中含有豐富的營養物質，如多糖、蛋白質、膳食纖維、維生素和礦物質等[2]。銀耳多糖是銀耳中最主要的生物活性成分，具有免疫調節、抗氧化、補水保濕、美容潤膚等功效，因其本身無毒副作用，在近年來引起國內外的廣泛關注[3-5]。Jiang等[6]的研究發現銀耳多糖可以誘導單核細胞產生免疫因子，通過提高腫瘤患者外周血T淋巴細胞水平來調節免疫作用。張黎君[7]的研究通過單因素和正交試驗確定了復合酶-鞣酸法提取銀耳多糖的最佳工藝，并對純化后多糖的吸濕保濕性進行了研究，將其應用于保濕性口紅。吳依娜[8]的研究發現采用閃式提取法從銀耳中獲得銀耳多糖，將其添加到橄欖油精華液中，可以用來改善受損發束的保濕性和彈性。由此可知，銀耳多糖具有市場價值，正逐漸應用于食品、醫藥、化妝品等各個領域，而銀耳多糖的提取優化和生物活性仍是當前研究的前提與關鍵。本試驗以銀耳多糖為原料，采用單因素和響應面試驗，優化得到銀耳多糖的最佳提取工藝，對純化后銀耳多糖的抗氧化和吸濕保濕性能進行探究，旨在為銀耳多糖的開發利用提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干銀耳：福建省古田縣大豐工貿有限公司，于80℃烘干備用。

透明質酸鈉：華西福瑞達生物醫藥有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘油、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷、無水碳酸鈉、無水硫酸銨、變色硅膠、抗壞血酸（vitamin C，VC）、硫酸亞鐵、過硫酸鉀：天津科密歐試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-5A臺式離心機：上海菲怡爾分析儀器有限公司；ALC-2103電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋、DHG-9246A電熱鼓風干燥機、DZF-6050真空冷凍干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；S3打漿機：東莞市阿道夫電器有限公司；透析袋（截留分子量3 500 Da）：北京經科宏達生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銀耳多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[9]測定銀耳多糖含量。準確配制1 mg/mL葡萄糖標準溶液，移取葡萄糖標準溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 于 6 個試管中，分別加水補至2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置于沸水浴中10 min，冷卻至室溫（25℃），于波長490 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[10]。曲線回歸方程：y=12.270 0x+0.036 7，相關系數R2=0.999 1。按下式計算銀耳多糖提取率。

式中：C為稀釋后多糖濃度，mg/mL；V0為多糖提取液體積，mL；N為稀釋倍數，mL；V1為供試樣品體積，mL；M 為干銀耳質量，mg。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 液料比對銀耳多糖提取率的影響

分別稱取干銀耳2 g于不同的錐形瓶中，按照液料比 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，于打漿機中打漿5 min后取出，置于80℃水浴鍋中浸提4 h，然后在4℃條件下，5 000 r/min離心10 min得上清液，即銀耳多糖提取液，計算提取率。

1.3.2.2 提取溫度對銀耳多糖提取率的影響

分別稱取干銀耳2 g于不同的錐形瓶中，各加入120 mL蒸餾水，于打漿機中打漿5 min后取出，分別置于 60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中浸提 4 h，然后在 4 ℃條件下，5 000 r/min離心10 min得上清液，即銀耳多糖提取液，計算提取率。

1.3.2.3 提取時間對銀耳多糖提取率的影響

分別稱取干銀耳2 g于不同的錐形瓶中，各加入120 mL蒸餾水，于打漿機中打漿5 min后取出，分別置于 80℃水浴鍋中浸提 2、3、4、5、6 h，然后在 4 ℃條件下，5 000 r/min離心10 min得上清液，即銀耳多糖提取液，計算提取率[11-14]。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，運用Box Behnken中心組合設計原理，以液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）作為自變量，多糖提取率作為響應值，設計三因素三水平試驗進行響應面分析，從而獲得銀耳多糖的最佳提取條件，響應面水平如表1所示。

表1 響應面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface

1.3.4 銀耳多糖的純化

將多糖提取液加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜12 h，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，并加入適量蒸餾水溶解，之后再加入1/2體積比Sevage試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1），振蕩30 min后，于4℃條件下，8 000 r/min離心10 min，得上層清液，重復多次直至無明顯蛋白質層出現為止。將去蛋白后的銀耳多糖溶液放入3 500 Da的透析袋中透析72 h，收集多糖溶液于真空冷凍干燥箱凍干得到銀耳多糖干品[15]。

1.3.5 銀耳多糖抗氧化活性的測定

根據劉瑞馨等[16]的方法，稍作修改，分別配制濃度為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 銀耳多糖溶液，以VC作為對照組，計算銀耳多糖對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基的清除率來探究銀耳多糖的抗氧化活性。

1.3.6 多糖吸濕保濕性能的測定

以銀耳多糖干品、透明質酸鈉、甘油為樣品，比較各組樣品的吸濕保濕性能。

分別稱取0.100 g的銀耳多糖、透明質酸鈉、甘油于玻璃培養皿中，25℃條件下將培養皿置于飽和碳酸鈉溶液（相對濕度43%）和飽和硫酸銨溶液（相對濕度81%）的干燥器中，分別在 1、3、6、12、24、36、48 h 稱量樣品和培養皿質量[17]。按下式計算吸濕率。

式中：W2為初始樣品和培養皿的質量，g；W1為特定時間吸濕后樣品和培養皿的質量，g；W0為初始樣品質量，g。

分別稱取0.500 g的銀耳多糖、透明質酸鈉、甘油于玻璃培養皿中，并均勻加入0.200 g蒸餾水，25℃條件下將玻璃培養皿置于變色硅膠（相對濕度0%）的干燥器中，分別在 1、3、6、12、24、36、48 h 稱量培養皿和樣品質量[18-19]。按下式計算保濕率。

式中：W0為初始水的質量，g；W1為特定時間后的水分質量，g。

1.3.7 數據分析

試驗均設置3組平行，數據采用Origin軟件作圖，結果以平均值±標準差表示，在“響應面方法”中，使用Design Expert 8.0.6軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對多糖提取率的影響

不同液料比對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquidto-material ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖 1 可知，當液料比在40∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）內，多糖提取率呈上升趨勢，在70∶1（mL/g）時達到最大，為（17.70±0.23）%，之后多糖提取率逐漸下降，可能是由于增加溶劑體積有利于增大其與浸提物的接觸面積，促進多糖的溶出，當溶劑達到一定體積時多糖溶出達到飽和，提取率會趨于平穩或者緩慢下降[20]，綜合考慮響應面優化試驗的液料比選擇60∶1、70∶1、80 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

不同提取溫度對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

如圖2所示，隨著提取溫度的升高，多糖提取率呈先上升后下降趨勢，當提取溫度為90℃時，多糖提取率達到（17.45±0.19）%，這說明提取溫度的升高會增加溶劑分子和溶質分子的運動，從而促進擴散作用，有利于提高多糖提取率。但提取溫度過高，可能會使多糖降解從而導致提取率降低[21]，因此，響應面試驗的提取溫度選擇 80、90、100℃。

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響

不同提取時間對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率持續升高，提取時間為2 h～4 h時，多糖提取率變化明顯，說明多糖溶出需要一定時間，在5 h時多糖提取率達到（15.31±0.18）%，之后多糖提取率變化較小，因此，響應面試驗的提取時間選擇4、5、6 h。

2.2 響應面優化結果

響應面試驗設計及試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到的二次方程如下。

方差分析結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

對二次模型進行方差分析，從表3中可以看出，該模型P＜0.01，具有極顯著性，失擬項P＞0.05，意味著失擬項相對于純誤差不顯著，決定系數R2=0.932 2＞90%，說明該模型擬合程度良好，誤差較小，該回歸方程能很好地描述各因素與響應值之間的關系[22]。一次項中A液料比與B提取溫度對多糖提取率的影響具有顯著性，C提取時間的影響不顯著；交互項AB、AC、BC均不顯著；二次項均達到極顯著水平。由回歸模型顯著性分析可知3個因素的主次順序為液料比＞提取溫度＞提取時間。

2.3 響應面分析

根據回歸分析得到的結果，作出相應的響應面圖和等高線圖，見圖4～圖6。

圖4 液料比與提取溫度對多糖提取率的響應面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effect of liquid-to-material ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

圖5 液料比與提取時間對多糖提取率的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of liquid-to-material ratio and extraction time on the extraction rate of polysaccharides

圖6 提取溫度與提取時間對多糖提取率的響應面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of extraction temperature and time on the extraction rate of polysaccharides

如圖4～圖6所示，提取溫度和液料比對多糖提取率的影響曲線較陡，說明其影響作用較為顯著，而提取時間的影響曲線較為平滑，說明影響不顯著，因素間的相互作用影響不顯著。

通過響應面試驗得到最佳提取條件為液料比79.33∶1（mL/g）、提取溫度 91.48℃、提取時間 4.94 h，多糖提取率20.24%。為了驗證工藝參數的可靠性，結合實際操作的方便性，將試驗工藝參數調整為液料比79 ∶1（mL/g）、提取溫度 91℃、提取時間 5 h，采取 3組試驗進行驗證，多糖提取率為（20.29±0.15）%，與預測結果接近。

2.4 銀耳多糖的抗氧化性測定結果

采用3種方式評價銀耳多糖的抗氧化能力，以VC作為陽性對照，測定不同濃度樣品對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS+自由基的清除率見圖7～圖9。

圖7 銀耳多糖對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on DPPH radical scavenging rate

圖8 銀耳多糖對羥基自由基清除率的影響Fig.8 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on hydroxyl radical scavenging rate

圖9 銀耳多糖對ABTS+自由基清除率的影響Fig.9 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on ABTS+radical scavenging rate

由圖7～圖9可知，DPPH自由基、羥基自由基、ABTS+自由基的清除作用均隨銀耳多糖溶液濃度的升高而逐漸增強，表明銀耳多糖質量濃度與清除率呈量效關系[23]。銀耳多糖對DPPH自由基清除率隨濃度上升變化較小，對羥基自由基和ABTS+自由基的清除率隨濃度增加變化較大，5 mg/mL時，DPPH自由基、羥基自由基、ABTS+自由基的清除率分別為47.31%、47.43%、52.14%，銀耳多糖對3種自由基的清除率是VC的50%左右。說明銀耳多糖具有一定的抗氧化能力，但與VC相比仍有一定的差距。

2.5 銀耳多糖的吸濕保濕性能

在相對濕度43%和相對濕度81%環境下，分別探究了銀耳多糖、透明質酸鈉和甘油的吸濕性，結果見圖10。

圖10 不同相對濕度條件下樣品的吸濕率變化情況Fig.10 Comparison of the moistureabsorption rate of the samples under different relative humidity

由圖10可知，在相對濕度43%條件下，銀耳多糖和透明質酸鈉吸濕速度較慢，且在24 h左右幾乎不再吸水，而甘油的吸濕效果最好。在48 h時，甘油、透明質酸鈉、銀耳多的吸濕率分別為83.03%、33.50%、25.15%。在相對濕度81%條件下，銀耳多糖和透明質酸鈉吸濕較低，在48 h時的吸濕率分別為53.50%、44.75%。而甘油具有極強的吸濕性，在48 h時吸濕率達到122.65%。3種樣品的吸濕速率均隨著時間的延長而逐漸減慢，且在相對濕度較大的環境中，相同時間內吸濕率普遍較高。由此可知，樣品的吸水作用與水分的蒸騰作用是同時進行的，當兩者達到動態平衡，吸濕率趨于不變，空氣濕度越大，樣品的吸濕率越大，這與孔合心等[24]的研究結果一致，符合二級吸附動力學模型[25]。

在干燥硅膠環境中，分別研究了銀耳多糖、透明質酸鈉和甘油的保濕性，如圖11所示。

圖11 在干燥硅膠條件下樣品的保濕率Fig.11 The moisture retention rate of the samples under dry silica gel condition

由圖11可知，在干燥環境下，3種樣品水分含量快速降低，隨著時間的延長水分的散失開始變得緩慢，銀耳多糖和透明質酸鈉在各個時間點的保濕效果相差較小。在48 h時，透明質酸鈉、銀耳多糖、甘油的保濕率分別為49.50%、42.15%、23.25%，銀耳多糖的保濕效果與透明質酸鈉接近。與甘油相比，銀耳多糖和透明質酸鈉中的親水基團能更好地降低水分有效擴散系數，導致水分擴散能力減弱，從而表現出良好的持水保濕作用[26]。

3 結論

本文分析了液料比、提取溫度和提取時間3個因素對銀耳多糖提取率的影響，此外，探究了銀耳多糖的抗氧化和吸濕保濕性能。最終得到銀耳多糖最佳提取工藝為液料比79∶1（mL/g）、提取溫度91℃、提取時間5 h，在此條件下多糖提取率達到（20.29±0.15）%；對3種自由基均有不錯的清除能力，且銀耳多糖濃度越高，清除能力越強，表明了銀耳多糖具有一定的抗氧化能力；在不同相對濕度環境中，銀耳多糖的吸濕性較弱，低于甘油和透明質酸鈉；但在干燥環境中具有良好的保濕性，遠高于甘油，與透明質酸鈉接近。銀耳多糖無任何毒副作用，易于提取且成本較低，可作為天然的抗氧化劑和保濕劑應用于食品、化妝品等行業。