美拉德反應(yīng)改性植物蛋白研究進(jìn)展

鄭乾坤，陳復(fù)生*，張朵朵，殷麗君

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

近年來，大多消費(fèi)者基于健康飲食而轉(zhuǎn)向純素食，因此研究用植物蛋白替代動(dòng)物蛋白成為了熱點(diǎn)[1]。由于蛋白質(zhì)對pH值、溫度和外部壓力的敏感性，其結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能特性和營養(yǎng)價(jià)值發(fā)生改變[2]，因此研究人員選擇不同方法改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或?qū)⑵渑c碳水化合物結(jié)合來改善蛋白質(zhì)的功能特性，其中常用方法是熱處理、乳化、發(fā)酵、水解、酶促和非酶促反應(yīng)等[3]。在上述方法中，使用美拉德反應(yīng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行非酶促糖基化被認(rèn)為是最有前途的方法之一。因?yàn)閰⑴c美拉德反應(yīng)所需的蛋白質(zhì)和多糖都是綠色、無毒、無污染的，并且美拉德反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行而不需要添加劑來引發(fā)，所以在食品工業(yè)中安全性較高[4-7]。

美拉德反應(yīng)是非酶促反應(yīng)，在受控條件下，美拉德反應(yīng)有利于糖基化蛋白質(zhì)增強(qiáng)功能特性，如熱穩(wěn)定性和溶解性[7]。然而反應(yīng)程度控制不當(dāng)時(shí)，美拉德反應(yīng)后期會(huì)產(chǎn)生諸多有害物質(zhì)。通過對溫度、時(shí)間、pH值及蛋白質(zhì)和多糖的質(zhì)量比等條件的控制來阻止美拉德反應(yīng)進(jìn)入更高級階段，防止形成有害成分[8]，將有助于多糖-蛋白復(fù)合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用以及生產(chǎn)新的增值食品。本文簡要概述美拉德反應(yīng)機(jī)理，綜述美拉德改性植物蛋白技術(shù)以及近年來對傳統(tǒng)植物蛋白進(jìn)行美拉德改性的研究。

1 美拉德改性蛋白質(zhì)的機(jī)理

美拉德反應(yīng)是一種非酶促反應(yīng)，其中游離氨基（蛋白質(zhì)、肽或氨基酸）與游離羰基（還原糖）反應(yīng)，經(jīng)歷復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和平行的化學(xué)轉(zhuǎn)化，形成共軛物和其他美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）。美拉德反應(yīng)可以分為3個(gè)階段：初級階段、高級階段和最終階段。這些階段是相互關(guān)聯(lián)的，可以同時(shí)發(fā)生，并受反應(yīng)條件的影響。美拉德反應(yīng)機(jī)理見圖1[9]。

圖1 美拉德反應(yīng)機(jī)理圖Fig.1 Maillard reaction mechanism

美拉德反應(yīng)的初級階段以初始糖基化反應(yīng)為特征，主要是還原糖的羰基與氨基酸中的游離氨基之間的縮合反應(yīng)，水分子釋放后形成N-糖基胺，再經(jīng)過不可逆的重排生成Amadori重排產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)高級階段始于Amadori重排產(chǎn)物的降解，這取決于體系的條件，如pH值、時(shí)間和溫度。當(dāng)pH值等于或低于7時(shí)，生成糠醛或羥甲基糠醛。當(dāng)pH值高于7時(shí)，生成還原酮及各種裂解產(chǎn)物，包括縮醛、丙酮醛和雙乙酰。這些裂解產(chǎn)物具有很高的活性，并參與新的反應(yīng)。最終階段仍有一系列的反應(yīng)發(fā)生，包括環(huán)化、脫水、逆醛化、重排、異構(gòu)化和縮合，還會(huì)形成棕色的含氮聚合物和共聚物，稱為類黑精[9-10]。與早期階段相比，美拉德反應(yīng)的高級和最終階段包含高度的復(fù)雜性。

2 美拉德改性蛋白質(zhì)的技術(shù)研究進(jìn)展

傳統(tǒng)的美拉德反應(yīng)改性蛋白質(zhì)方法有干熱法和濕熱法。然而對植物來源的蛋白質(zhì)來說，由于緊密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)阻礙了活性氨基與糖的羰基反應(yīng)，導(dǎo)致美拉德反應(yīng)速率較慢[11]。因此，許多學(xué)者將研究重點(diǎn)放在不同的輔助技術(shù)上，如超聲波處理、靜電紡絲和微波等輔助技術(shù)，這些輔助技術(shù)可以打開蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)、加快美拉德反應(yīng)速率、提升美拉德反應(yīng)的結(jié)合效果。這些輔助技術(shù)有其自身的優(yōu)勢和局限性，它們可以顯著改善蛋白質(zhì)的功能特性，也可以影響美拉德反應(yīng)的初始階段，減少晚期美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物的形成。因此有必要進(jìn)行研究，以了解它們對多糖-蛋白質(zhì)共軛物的結(jié)構(gòu)、功能和生物活性的影響。

2.1 超聲波輔助技術(shù)

超聲波由頻率超過20 kHz的聲波組成，在液體中可以產(chǎn)生空化氣泡，空化氣泡內(nèi)爆產(chǎn)生高能量，介質(zhì)中的粒子在超聲波的作用下產(chǎn)生劇烈振動(dòng)，引起介質(zhì)間相互作用，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。超聲波對美拉德反應(yīng)的影響見圖2[9]。

圖2 超聲波對美拉德反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of ultrasound on Maillard reaction

如圖2所示，超聲波輔助技術(shù)能大幅度提高處理速度、效率和質(zhì)量，主要應(yīng)用于改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，例如乳化、結(jié)構(gòu)和其他功能屬性[12]。

葛偉[13]的研究表明，酪蛋白-葡萄糖的糖基化反應(yīng)程度隨著超聲時(shí)間的延長先增加后減小，在20 min時(shí)反應(yīng)程度最大。隨著超聲功率的增加，反應(yīng)程度隨之增大，并在450 W時(shí)達(dá)到最大。Zhao等[14]研究超聲波預(yù)處理對大豆蛋白-葡萄糖/麥芽糖共軛物的物理化學(xué)特性和流變學(xué)特性的影響，與未經(jīng)處理的樣品相比，超聲波預(yù)處理會(huì)使共軛物糖基化程度增加、褐變強(qiáng)度降低、顆粒大小和三級結(jié)構(gòu)的展開增加。Cui等[15]研究經(jīng)超聲預(yù)處理制備的大豆分離蛋白-葡萄糖共軛物對分子柔韌性和乳化性能的影響。結(jié)果表明，隨著超聲強(qiáng)度的增加，反應(yīng)速率明顯增加。預(yù)處理后，由于粒徑減小和結(jié)構(gòu)疏松，形成的共軛物柔韌性顯著增加，這與共軛物的乳化能力增強(qiáng)有關(guān)。Mu等[16]使用超聲波輔助預(yù)處理將大豆分離蛋白與阿拉伯樹膠接枝，發(fā)現(xiàn)使用超聲波輔助預(yù)處理進(jìn)行美拉德改性所需的時(shí)間為60 min，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)方法所需的48 h。經(jīng)過預(yù)處理后大豆分離蛋白的α-螺旋和β-折疊明顯減少，二級結(jié)構(gòu)無序卷曲增加。可以看出，采用超聲波輔助美拉德反應(yīng)，可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，縮短美拉德反應(yīng)的時(shí)間，增加美拉德反應(yīng)的程度，同時(shí)共軛物的功能特性得到改善。但過度超聲處理也會(huì)導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs） 等有害物質(zhì)的形成，這可能會(huì)阻礙超聲波的潛在應(yīng)用。因此，必須平衡預(yù)處理以避免形成晚期糖基化產(chǎn)物，同時(shí)提高結(jié)合率。

2.2 微波輔助技術(shù)

與其他的美拉德改性輔助技術(shù)相比，微波輔助美拉德改性反應(yīng)條件更溫和，共軛效率也更穩(wěn)定[17]。微波輔助改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的原理主要體現(xiàn)在微波輔助處理時(shí)，極性基團(tuán)吸收微波，產(chǎn)生自由基，改變蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的乳化和溶解性[18]。

畢偉偉等[19]的研究發(fā)現(xiàn)微波對酪蛋白糖基化的反應(yīng)程度和速率隨著微波功率和微波時(shí)間的增大逐漸增加，但是在微波功率達(dá)到500 W、微波時(shí)間20 min時(shí)，接枝度達(dá)到最大。Guan等[20]利用微波加熱研究大豆蛋白與低聚糖（乳糖、麥芽糖、葡聚糖和可溶性淀粉）的接枝反應(yīng)，研究表明：微波加熱處理后，美拉德反應(yīng)速率分別是傳統(tǒng)加熱的6、7、57、12倍。這意味著微波加熱與傳統(tǒng)加熱相比顯示出類似的共價(jià)鍵結(jié)合，但需要更低的活化能，因此可以有效地避免AGEs的形成。Cheng等[21]研究微波處理對大米蛋白和葡聚糖之間美拉德反應(yīng)的影響，研究發(fā)現(xiàn)微波預(yù)處理提高了糖基化速率，溶解度明顯增加，微波加熱5 min內(nèi)溶解度增加64%，而常規(guī)加熱5 min內(nèi)溶解度增加24%。以上研究表明，與傳統(tǒng)加熱相比，微波輔助得到的共軛物功能和生物活性得到了改善，證明了微波輔助美拉德改性的優(yōu)勢。

2.3 靜電紡絲輔助技術(shù)

靜電紡絲是一種靜電纖維制造技術(shù)，可將生物分子構(gòu)造成纖維[22]。靜電紡絲原理圖及其對美拉德共軛物的影響見圖3[23]。

圖3 靜電紡絲原理圖及其對美拉德共軛物的影響Fig.3 Schematic diagram of electrospinning and its effect on Maillard conjugate

如圖3所示，靜電紡絲由于其拉伸和彎曲運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致生物分子結(jié)構(gòu)重新排列，而生物分子結(jié)構(gòu)由于聚合物鏈纏結(jié)而變得完整，主要影響因素有溶液黏度、多糖濃度、纖維大小、蛋白質(zhì)與多糖的混合比、溫度和濕度的影響。通過靜電紡絲輔助美拉德改性，反應(yīng)時(shí)間縮短，糖化程度增強(qiáng)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，復(fù)合物生成量增加[24]。

與傳統(tǒng)的干法或濕法加熱方法相比，利用靜電紡絲輔助制備的豌豆蛋白-麥芽糊精基共軛物[25-27]的不同功能性質(zhì)有所改善。改變電紡多糖纖維中羰基含量可以調(diào)節(jié)糖基化程度。共軛物的溶解度從34%增加到44%，這與疏水性蛋白質(zhì)與親水性碳水化合物的結(jié)合有關(guān)，也增加了形成共軛物氫鍵的能力。靜電紡絲輔助美拉德共軛技術(shù)已用于成膜，學(xué)者研究了靜電紡絲明膠-葡萄糖[28]和玉米醇溶蛋白/明膠纖維-葡萄糖[29]美拉德共軛對潤濕性、機(jī)械性能和生物相容性的影響。結(jié)果表明，彈性模量和生物相容性得到提高，所得膜具有可調(diào)的潤濕性和非細(xì)胞毒性。靜電紡絲技術(shù)作為預(yù)處理的方式促進(jìn)美拉德結(jié)合物的生成，以及在植物蛋白質(zhì)溶解度提升方面，在蛋白質(zhì)修飾中的潛力較大。

2.4 高壓輔助技術(shù)

在高壓加工中，待加工的產(chǎn)品浸沒在充滿液體（水、硅油、苯甲酸鈉、乙醇、乙二醇、蓖麻油等）的壓力容器系統(tǒng)中，液體充當(dāng)壓力傳遞介質(zhì)，蛋白質(zhì)基于壓力會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象轉(zhuǎn)變、體積變化和多糖無定形和結(jié)晶區(qū)域的重排以及水的侵入[30]。Moreno等[31]研究高壓處理對大豆分離蛋白7S和11S球蛋白乳化活性和穩(wěn)定性的影響。由于高壓處理會(huì)使蛋白質(zhì)單體的部分或全部變性，增強(qiáng)表面活性，這些蛋白質(zhì)在不同壓力下表現(xiàn)出更好的表面疏水性、乳液穩(wěn)定性和活性。Moreno等[31]進(jìn)行了基于葡萄糖-賴氨酸-美拉德反應(yīng)的模型系統(tǒng)研究，壓力為400 MPa，pH值范圍為5～10，發(fā)現(xiàn)壓力處理并不會(huì)影響Amadori重排產(chǎn)物的形成，但由于壓力誘導(dǎo)的酸解離（pH＜8）導(dǎo)致中晚期MRP的形成受到顯著抑制。而在pH值為10.2時(shí)，高壓加速了中期和晚期階段的AGEs形成。

戊糖苷是美拉德反應(yīng)過程中形成的蛋白質(zhì)結(jié)合熒光標(biāo)記物之一，是確定美拉德反應(yīng)階段和強(qiáng)度的指標(biāo)。Schwarzenbolz等[32]研究美拉德反應(yīng)期間高靜水壓對戊糖苷形成的影響，在高達(dá)600 MPa的壓力下測試了由N-乙酰精氨酸、N-乙酰賴氨酸和核糖組成的溶液，發(fā)現(xiàn)Amadori重排產(chǎn)物的降解因高壓處理而減少，結(jié)果表明高壓處理有助于控制MRP的形成并阻止晚期糖基化。

2.5 脈沖電場輔助技術(shù)

脈沖電場技術(shù)（pulsed electric field，PEF）是將短脈沖電施加于兩個(gè)電極之間的電場技術(shù)，應(yīng)用于食品工業(yè)的脈沖電場強(qiáng)度一般為0.1 kV/cm～80.0 kV/cm。PEF處理導(dǎo)致美拉德結(jié)合物的功能特性發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，游離氨基酸含量增加，并抑制蛋白質(zhì)的熱誘導(dǎo)聚集[33]。PEF處理可對多糖和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，從而對糖基化的速率、效率和熱性能產(chǎn)生積極影響[34]。

基于天冬酰胺-葡萄糖[35]、天冬酰胺-果糖[36]和甘氨酸-葡萄糖[37]美拉德模型系統(tǒng)，學(xué)者研究了PEF對美拉德反應(yīng)的影響。在28 kV/cm的場強(qiáng)下，反應(yīng)速率和MRP形成相比明顯增加。陳剛等[38]研究了脈沖電場對于不同還原糖-谷氨酸鈉溶液的pH值、中間產(chǎn)物、褐變、還原糖含量以及抗氧化活性的影響，當(dāng)脈沖電場處理?xiàng)l件為場強(qiáng)4 kV/cm，時(shí)間1.88 ms，得到的果糖-甘氨酸鈉體系在294 nm和420 nm處的吸光度從0分別增加到1.71和0.07，同時(shí)，抗氧化活性增加10.96%，果糖含量減少55%，表明脈沖電場對于果糖-谷氨酸鈉體系的美拉德反應(yīng)有明顯影響。

3 美拉德反應(yīng)改性植物蛋白研究現(xiàn)狀

植物蛋白具有能提供高營養(yǎng)價(jià)值、低過敏性、易獲得性和較低成本等優(yōu)勢，經(jīng)修飾后可以賦予蛋白不同的功能，在食品加工業(yè)中備受關(guān)注[39]。大豆蛋白是最受歡迎的植物蛋白之一，在工業(yè)生產(chǎn)中所占比重大以及成本較低。大豆蛋白由大豆球蛋白（＞70%）和β-伴大

豆球蛋白組成，與單糖或雙糖（葡萄糖[15]、麥芽糖/葡萄糖[14，40]、核糖[41]、果糖[42]）和多糖（香豆膠[43]、葡聚糖[44-45]、阿拉伯樹膠[46]、麥芽糖糊精[47-48]）結(jié)合，使用傳統(tǒng)或改進(jìn)的糖基化技術(shù)對其改性，并進(jìn)行理化性質(zhì)和功能性分析。美拉德共軛物對乳液穩(wěn)定性、溶解性、熱穩(wěn)定性和表面疏水性等功能性質(zhì)有明顯影響。與其他植物蛋白質(zhì)相比，豌豆蛋白的乳化能力、表面電荷和溶解度較低，但其過敏性和成本也低，所以用阿拉伯樹膠[24]、果膠[39]和麥芽糖糊精[49]通過美拉德反應(yīng)對豌豆蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其乳化活性。花生蛋白與其他豆科蛋白質(zhì)（大豆除外）相比表現(xiàn)出更好的功能特性，但因溶解度太低而未能充分利用。使用葡聚糖通過美拉德改性可以改善花生蛋白的功能性質(zhì)[7]，通過超聲輔助美拉德反應(yīng)可以克服花生蛋白糖基化難的問題[50-52]。超聲波使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，增加親水性氨基酸殘基的暴露，溶解性提高從而使糖基化效率明顯提高。表1列出了多種植物蛋白通過美拉德反應(yīng)與碳水化合物復(fù)合的研究現(xiàn)狀。

表1 近年來不同植物蛋白通過美拉德改性研究內(nèi)容Table 1 Research contents of Maillard modification of different plant proteins in recent years

4 結(jié)語

美拉德反應(yīng)顯示出修飾植物源性蛋白質(zhì)的潛力，但其傳統(tǒng)的反應(yīng)方法所需周期長，效果不顯著。為了改善傳統(tǒng)反應(yīng)方法的缺點(diǎn)，各種新穎的預(yù)處理技術(shù)相繼出現(xiàn)。這些預(yù)處理技術(shù)在輔助美拉德改性植物蛋白方面效果明顯，但多數(shù)研究是使用單一糖或蛋白質(zhì)模型系統(tǒng)進(jìn)行，而食品是復(fù)雜體系，因此還需要進(jìn)行更深層次的系統(tǒng)性研究。目前通過美拉德反應(yīng)修飾植物蛋白主要集中在傳統(tǒng)植物蛋白，而對于一些非傳統(tǒng)的植物源蛋白還缺乏研究。植物蛋白的美拉德改性在食品工業(yè)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，因此進(jìn)一步對改性后的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物進(jìn)行功能性和生理活性研究，將有助于提高植物蛋白的應(yīng)用價(jià)值，也有助于開發(fā)植物源功能性食品。