p16和HPV DNA檢測在ASC-US分流中的價值研究

游偉強 王莉平 吳小延 葉才果 方小龍 林立鵬

1 深圳市福田區婦幼保健院檢驗科(深圳 518016) 2 中山大學腫瘤防治中心分子診斷科(廣州 510060) 3 廣東醫科大學廣東省醫學分子診斷重點實驗室(東莞 523808)

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤中對女性造成巨大危害的惡性腫瘤，全球約有50萬病例，其中大約四分之三的新近病例發生于醫療資源缺乏的國家[1]。在宮頸細胞學診斷的異常結果中，不能明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)占據了一半以上，數量十分巨大[2- 3]。Srivastava AN等[4]研究了1 473例液基薄層細胞學(thinprep cytology test，TCT)最初診斷和質量控制回顧性復習診斷的符合率僅為42.97%，ASC-US在不同觀察者之間診斷的重復性差，誤診和漏診的可能性較大，但是其對應的宮頸活檢結果可以從宮頸炎到宮頸癌，這給臨床醫師的治療帶來較多的困惑。Gothwal M等[5]和曹潔瓊等[6]研究發現，宮頸細胞學p16蛋白檢測被認為在ASC-US分流中具有較高的潛力，但是其敏感性較差，以致于漏診現象常有發生。Wang M等[7]和劉曉旭等[8]研究報道，使用高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)DNA檢測對ASC-US進行分流的靈敏度高于TCT檢測，但是其特異度差，假陽性率偏高。鑒于ASC-US分流的臨床價值高，但目前針對ASC-US的分流尚未提出有效策略，為解決此難題，本研究團隊組織開展了此研究。

1 資料和方法

1.1 標本來源

收集2017年3月—2022年1月，585例TCT診斷結果為ASC-US患者的宮頸細胞學標本，使用免疫細胞化學法行p16蛋白檢測，生物芯片法行HPV DNA基因分型檢測。p16蛋白檢測和HPV DNA基因分型檢測中只要有一項檢測結果為陽性則為聯合檢測的陽性結果。患者年齡23.26～78.95歲，平均(39.65±12.91)歲。患者采集標本前3天無同房，采集時間為月經干凈后3～7天。患者于8周內行陰道鏡下病理活檢術。研究方案經本單位倫理委員會審批通過(倫理批件號：B2016- 069- 11)。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑及儀器 p16抗體檢測試劑盒、巴氏染色試劑盒、PathCIN IHC-Autocyto-Ⅲ全自動TCT制片機和PathCIN IHC-SY7300全自動免疫細胞化學染色儀由深圳市森盈生物科技有限公司生產。人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒(生物芯片法)和BHF-V1核酸芯片檢測儀由北京博暉創新生物技術集團股份有限公司生產。

1.2.2 宮頸細胞學、宮頸活檢標本的制作及診斷依據：采集人體子宮頸口脫落細胞，使用全自動制片機制作TCT薄片，細胞學診斷結果參考TBS- 2014分類標準[9]。SLC- 3000電子陰道鏡數字成像系統下取患者宮頸組織，組織學診斷檢材的制備技術流程參與臨床技術操作規模[10]執行，主要包括：甲醛固定、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片及蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色等步驟。HE染色具體步驟為：二甲苯5 min共2次，100%酒精2 min共2次，95%酒精2 min共2次，80%酒精1 min，蒸餾水1 min，蘇木精染色5 min，蒸餾水1 min，1%鹽酸酒精2 s，蒸餾水2 s，1%氨水5 s，蒸餾水1 min，0.5%伊紅染色2 min，蒸餾水2 s，80%酒精2 s，95%酒精2 min共2次，100%酒精2 min共2次，二甲苯3 min共3次，中性樹膠封固。組織學診斷結果參考世界衛生組織發布的第5版分類標準[11]。本研究以高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)以上病變，含HSIL和宮頸癌，作為疾病研究的終點。

1.2.3 宮頸細胞學的巴氏染色、p16抗體免疫細胞化學染色流程與結果判讀：①宮頸細胞學巴氏染色流程：TCT片入95%酒精15 min，蘇木精染色10 min，鹽酸酒精分化5 s，氨水返藍5 s，70%酒精1 min，80%酒精1 min，95%酒精1 min，橘黃G4 5 min，95%酒精2 min，EA505 min，95%酒精2 min，100%酒精2 min，二甲苯透明2 min，中性樹膠封片。染色結果判讀[12]：細胞核深藍色，鱗狀上皮底層、中層及表層角化前細胞質染綠色，表層不全角化細胞胞質染粉紅色。②p16抗體免疫細胞化學染色流程：把制作好的TCT片放在SY7300免疫組化染色機上，按儀器及試劑使用說明書要求，完成宮頸細胞學p16抗體免疫細胞化學染色。染色結果判讀[13]，p16陰性：細胞核或胞質無色或不顯色。p16陽性：細胞核/胞質染成棕黃色。

1.2.4 HPV DNA基因分型檢測流程與結果判讀：①檢測流程：婦產科醫師使用頸刷采集患者適量的宮頸上皮細胞樣本，實驗室人員充分洗脫宮頸刷，并將洗脫液以3 000 r/min離心10 min，棄上清液，混勻，取200 μL放入加樣孔，完成核酸提取、PCR擴贈、雜交和分析等實驗步驟。實驗設立陽性和陰性對照。②結果判讀：1)陽性結果判定：雜交膜的SP點(3個)均有陽性斑點，內參質控點(3個)的GB- 50點有陽性斑點，且有HPV探針陽性斑點出現，為該探針對應亞型陽性；2)陰性結果判定：雜交膜的SP點(3個)均有陽性斑點，內參質控點(3個)的GB- 50點有陽性斑點，且無HPV探針陽性斑點出現，為該探針對應亞型陰性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計數資料，以(%)表示，采用χ2檢驗比較率的總體差異。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸細胞學巴氏染色、p16蛋白免疫細胞化學染色結果

ASC-US細胞具有鱗狀分化、核質比增高和胞核改變的三個基本特征，見圖1A。宮頸脫落細胞胞核/胞質不顯色(p16陰性)，見圖1B。宮頸脫落細胞胞核染成棕黃色(p16陽性)，見圖1C。

圖1 宮頸細胞學巴氏染色、p16蛋白免疫細胞化學染色圖片(×400)注：A：宮頸細胞學的ASC-US診斷圖片(巴氏染色法)；B：ASC-US的p16蛋白陰性表達圖片(免疫細胞化學法)；C：ASC-US的p16蛋白陽性表達圖片(免疫細胞化學法)

2.2 宮頸細胞 ASC-US對應的組織學診斷結果

585例ASC-US 患者的宮頸活檢結果種類豐富，包括：慢性宮頸炎組302例(51.62%)、低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)組176例(30.09%)，HSIL組98例(16.75%)、宮頸癌組9例(1.54%)。4組不同的宮頸活檢結果反映了宮頸上皮細胞從宮頸炎-上皮內病變-宮頸癌等不同病理變化過程。見圖2。

圖2 宮頸細胞 ASC-US對應的組織學診斷圖片(×400)注：A：組織學診斷為慢性宮頸炎的圖片(HE染色法)；B：組織學診斷為LSIL的圖片(HE染色法)；C：組織學診斷為HSIL的圖片(HE染色法)；D：組織學診斷為宮頸癌的圖片(HE染色法)

2.3 三種不同檢測方法在不同級別宮頸病變中陽性率的比較

三種不同檢測方法在慢性宮頸炎組(χ2=16.00，P<0.001)、LSIL組(χ2=15.65，P<0.001)、HSIL組(χ2=62.72，P<0.001)中的陽性率總體差異具有統計學意義。在慢性宮頸炎組中，p16免疫細胞化學與HPV DNA基因分型檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。p16免疫細胞化學與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。在LSIL組中，p16免疫細胞化學與HPV DNA基因分型檢測法差異具有統計學意義(P=0.001)。p16免疫細胞化學與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。在HSIL組中，p16免疫細胞化學與HPV DNA基因分型檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。p16免疫細胞化學與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。

p16免疫細胞化學檢測法(趨勢χ2=70.46，P<0.001)、HPV DNA基因分型檢測法(趨勢χ2=109.31，P<0.001)、(p16+HPV DNA)聯合檢測法(趨勢χ2=151.70，P<0.001)在慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組、宮頸癌組中的陽性率有遞增趨勢。使用p16免疫細胞化學檢測法，慢性宮頸炎組與LSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與HSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P<0.001)、LSIL組與HSIL組差異具有統計學意義(P=0.001)、LSIL組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P=0.001)、HSIL組與宮頸癌組差異無統計學意義(P=0.044)。使用HPV DNA基因分型檢測法，慢性宮頸炎組與LSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與HSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P<0.001)、LSIL組與HSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、LSIL組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P=0.005)。使用(p16+HPV DNA)聯合檢測法，慢性宮頸炎組與LSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與HSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、慢性宮頸炎組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P<0.001)、LSIL組與HSIL組差異具有統計學意義(P<0.001)、LSIL組與宮頸癌組差異具有統計學意義(P=0.006)。見表1。

表1 3種不同檢測方法在不同級別宮頸病變中陽性率的比較

2.4 三種檢測方法對HSIL以上病變診斷效能的比較

三種檢測方法診斷HSIL以上病變靈敏度的總體差異具有統計學意義(χ2=63.61，P<0.001)。p16免疫細胞化學檢測法與HPV DNA基因分型檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。p16免疫細胞化學檢測法與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。HPV DNA基因分型檢測法與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。

三種檢測方法診斷HSIL以上病變特異度的總體差異具有統計學意義(χ2=29.94，P<0.001)。p16免疫細胞化學檢測法與HPV DNA基因分型檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。p16免疫細胞化學檢測法與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異具有統計學意義(P<0.001)。HPV DNA基因分型檢測法與(p16+HPV DNA)聯合檢測法差異無統計學意義(P=0.841)。

三種檢測方法診斷HSIL以上病變符合率的總體差異無統計學意義(χ2=5.54，P=0.063)。(p16+HPV DNA)聯合檢測方法診斷HSIL以上病變的約登指數值最大。見表2。

表2 不同方法對HSIL以上病變診斷效能比較

3 討 論

宮頸癌目前仍然是我國的女性腫瘤死亡的主要原因之一，且有年輕化的趨勢，與較富裕的北美和歐洲國家相比，其發生率和死亡率仍存在較大的差異[14]。Abdulaziz等[15]對500多個宮頸癌篩查實驗室進行調研后發現，宮頸細胞學篩查的異常結果中，ASC-US是最常見的類型。ASC-US報告率介于5%～10%之間。ASC-US的細胞學診斷結果仿佛就是一把雙刃劍。一方面，雖然其診斷的重復性很差，但是ASC-US的判讀標準較低，最大程度識別了宮頸異常細胞，有助于早期甄別潛在癌前病變或者早期浸潤癌。另一方面，據Kuroki等[16]研究報道，最終有4.3%～25%的ASC-US患者可能發展成宮頸上皮內瘤變Ⅱ/Ⅲ及以上病變，ASC-US的診斷結果可能會引起患者的恐慌。因此，探索一種靈敏度好、特異性高的ASC-US分流方法的臨床價值是非常高的。

宮頸細胞學ASC-US病例，組織學診斷結果囊括了宮頸病變從良性到惡性的一個發生、發展的連續變化過程。通過宮頸細胞學ASC-US的篩查，發現HSIL的風險雖不高，但確實是存在的，本研究發現的組織學診斷結果在HSIL以上病變的比例為18.29%，與陳飛等[17]報道的200例ASC-US患者的宮頸活檢結果中CINⅡ以上病變為36例，比例為18%，結果基本一致。本研究對象為585例ASC-US患者的宮頸活檢結果，數據量更大，統計學結果更為真實，研究結論更嚴謹。與上一版使用的三級分類(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)相比，本研究采用最新的第5版二級分類(LSIL和HSIL)與生物學行為的相關性更好，組織學診斷的重復性更佳，研究結果可能更具合理性和科學性。

p16是一種重要的抑癌蛋白，在高危型HPV感染的腫瘤中高表達。高危型HPV感染被認為是引起宮頸癌的病因。本研究從兩個不同的視角比較了p16免疫細胞化學、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)聯合檢測法在不同級別宮頸病變中陽性率。第一個視角，探討了三種不同檢測方法在同一級別宮頸病變中陽性率的差異，表1的實驗數據證實，(p16+HPV DNA)聯合檢測在同一級別宮頸病變中陽性率均高于p16免疫細胞化學、HPV DNA基因分型檢測，這表明聯合檢測提高了同一級別的宮頸病變的檢出率。蔡春芳等[18]研究報道，ASC-US患者的p16蛋白陽性率為24.08%(46/191),與本研究報道的p16蛋白陽性率29.06%(170/585)非常接近；劉曉旭等[19]研究報道，ASC-US患者的HPV DNA陽性率為50.5%(186/368),與本研究報道的陽性率45.81%(268/585)也非常接近。之所以出現這種比例上的細微差別，很可能是因為研究的標本量不同造成的。第二個視角，比較了同一檢測方法在慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌組中陽性率的差異，表1的實驗數據顯示，p16免疫細胞化學、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)聯合檢測的陽性率隨著宮頸病變程度的加重而遞增。說明p16免疫細胞化學、HPV DNA基因分型單獨和聯合檢測與宮頸病變程度是具有正向線性相關的。這與Song F等[20]研究結論一致。

本研究比較了p16免疫細胞化學、HPV DNA基因分型、(p16+HPV DNA)聯合檢測對HSIL以上病變診斷效能，表2的實驗數據顯示，(p16+HPV DNA)聯合檢測的靈敏度最大，較單獨檢測而言，能更大程度識別癌前病變和早期癌。盡管聯合檢測的特異度有所下降，但是表2中的約登指數這一能反映靈敏度和特異度的綜合表現能力的指標證實，聯合檢測的約登指數是最佳的，與此同時符合率也較高。因此，(p16+HPV DNA)聯合檢測對ASC-US分流價值較好，建議臨床推廣使用。