金花茶葉提取物體內(nèi)祛痰、抗炎作用及其機(jī)制研究

曾英港，陳輝華，鐘益寧，2*，李麗娟，李 玲，蔡秀琳

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200；2.玉林師范學(xué)院，廣西 玉林537000)

金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)為山茶科山茶屬，是一種小型常綠喬木，高2～5 m[1]。金花茶物種較多集中在廣西，我國云南、肇慶、四川、貴州等地也有分布和栽培，其中，廣西防城港還將金花茶定為“市花”。其葉和花均是傳統(tǒng)壯藥，《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]對(duì)其有收錄記載，金花茶可以藥食兩用，被開發(fā)成許多高附加值產(chǎn)品應(yīng)用到保健養(yǎng)生、美容護(hù)膚、食品添加等多個(gè)方面。

目前金花茶葉的研究方向主要涵蓋藥材鑒定、藥材栽培、化學(xué)成分鑒定、含量成分測定、藥理活性研究等方面，而藥理作用研究主要集中在抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗菌和抗過敏等方面[3-4]。因地域局限，國外對(duì)其研究較少。據(jù)《中華本草》[5]《現(xiàn)代本草綱目》[6]記載，金花茶葉具有清熱解毒、止痢的功效，治療咽喉炎、高血壓、便血、月經(jīng)不調(diào)等也有一定效果。本研究探討金花茶葉醇提取物的祛痰和抗炎活性作用及其可能機(jī)制，以期為今后金花茶的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為研發(fā)防治或改善呼吸系統(tǒng)炎癥的創(chuàng)新藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。

1.1.2 藥品與試劑 金花茶葉(防城港市防城港區(qū)農(nóng)場)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室滕建北教授鑒定為山茶科山茶屬金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)的干燥葉；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：170768)；急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號(hào)：18100110)；生理鹽水(廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：R18050804)；苯酚紅(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180927)；二甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：1902222)；角叉菜膠(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：9000-07-1)；酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢基因美科技有限公司，批號(hào)：JYM0531Mo、JYM0554Mo、JYM0218Mo、JYM0012Mo)；95%乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2017112301)；甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：1902222)；濃氨水(成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)，批號(hào)：2015012001)。

1.1.3 儀器 HH-S4電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)；電子天平(瑞安市英衡電器有限公司)；SQP分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；UV-1780紫外分光光度計(jì)(島津儀器(蘇州)有限公司)；WH-2000超聲波霧化器(廣東粵華醫(yī)療器械廠)；酶標(biāo)儀(Tecan公司)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(韶關(guān)市科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金花茶葉醇提取物的制備 選取適量金花茶葉，分別用70%、60%、50%乙醇溶液80 ℃依次水浴回流提取3次，每次1 h，合并過濾、濃縮，將濃縮液定容，得到醇提取物儲(chǔ)備液。使用時(shí)，稀釋得到濃度分別為20 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL的金花茶葉醇提取物溶液。

1.2.2 陽性組溶液的制備 取地塞米松片12片(0.75 mg/片)研磨成細(xì)粉，用生理鹽水溶解，得到濃度為0.2 mg/mL的地塞米松溶液。

1.2.3 祛痰實(shí)驗(yàn) ①酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取酚紅5.000 mg，加入氫氧化鈉溶液溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶用5%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行稀釋，定容，制得50 μg/mL酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別精密吸取酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，充分搖勻，選取其中1個(gè)樣品，以紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行掃描，記錄λmax，并在λmax處測定5個(gè)樣品的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，酚紅濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線。②酚紅排泌實(shí)驗(yàn)：取SPF級(jí)昆明種小鼠，每只體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組 12只，即空白組、陽性組(急支糖漿組)、金花茶葉醇提物的低、中、高劑量組。連續(xù)灌胃給藥7 d，采用酚紅排泌法[7]，末次給藥0.5 h后，對(duì)小鼠腹腔內(nèi)注射5%酚紅溶液2 mL，0.5 h后，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，加入0.9%生理鹽水2 mL、1 mol/L NaOH 0.1 mL浸泡1 h，再超聲10 min，離心3 min，3 000 r/min，取上層清液于559 nm測定其吸光度值，計(jì)算出小鼠氣管中酚紅的含量。

1.2.4 抗炎實(shí)驗(yàn) ①耳腫脹實(shí)驗(yàn)：參考文獻(xiàn)[8]，取SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分為5組，每組12只，即提取物低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.5 g/kg、2.5 g/kg)，陽性組(地塞米松組5 mg/kg)，空白組。除空白組給予蒸餾水，其他組給予相應(yīng)藥物。連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥0.5 h后，用二甲苯涂抹小鼠右耳，40 μL/只，1 h后將每組小鼠脊椎脫臼處死，用8 mm耳片打孔器在同一部位處打出小鼠的左、右耳片，精密稱重小鼠耳片重量，算出抑制率。計(jì)算公式：耳腫脹度=右耳片的重量-左耳片的重量；抑制率=(空白組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/空白組腫脹度均值×100%。②足腫脹實(shí)驗(yàn)：小鼠分組、給藥方法同“耳腫脹實(shí)驗(yàn)”，參考文獻(xiàn)[8]。末次給藥1 h后，在小鼠右足趾同一部位(右后足朝向踝關(guān)節(jié)方向)皮下注射0.1 mL 的1.0% 角叉菜膠溶液，用于制造炎癥模型，并于致炎后再灌胃給予相應(yīng)藥物1次，觀察小鼠足趾腫脹程度，4 h后將每組小鼠脊椎脫臼處死，用剪刀沿踝關(guān)節(jié)剪下兩足，并精密稱量各組小鼠足趾質(zhì)量，計(jì)算抑制率。計(jì)算公式：足腫脹度=右足質(zhì)量-左足質(zhì)量；抑制率=(空白組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/空白組腫脹度均值×100%。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9]，分組給藥方式與“1.2.4”項(xiàng)下相同，每天灌胃給藥2次，連續(xù)14 d，末次給藥1 h后，除了空白組，精密吸取300 μL二甲苯溶液涂抹在其余組小鼠右側(cè)的腹部和背部，同時(shí)將0.4% 醋酸溶液進(jìn)行腹腔注射，0.2 mL/只，用于制造炎癥模型。在致炎3 h后眼球取血，將血液全部收集在2.5 mL的離心管中。將血液樣品進(jìn)行離心20 min，3 000 r/min，取上清按ELISA試劑盒說明書的操作步驟，對(duì)血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A進(jìn)行含量測定，若樣品出現(xiàn)沉淀，需要離心后再進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 金花茶葉醇提取物對(duì)小鼠的祛痰作用

得到的酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.183 2x+0.016 11，R2=0.999 8，其中y為吸光度值，x為酚紅溶液的濃度(μg/mL)。與空白組比較，金花茶葉醇提取物各劑量組小鼠氣管酚紅的排泌量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且急支糖漿組酚紅的排泌量少于高劑量組。結(jié)果見表1。

表1 金花茶葉醇提取物祛痰作用結(jié)果

2.2 金花茶葉醇提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹作用

涂抹二甲苯溶液后，觀察各組小鼠的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)每組小鼠耳朵都有不同程度的腫脹，且部分小鼠的耳朵血管變紅，清晰可見。與空白組比較，地塞米松組、提取物各劑量組均能夠顯著抑制二甲苯引起的耳腫脹(P<0.01)。隨著金花茶葉醇提取物的劑量增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)，且中、高劑量組優(yōu)于地塞米松組。具體結(jié)果見表2。

表2 金花茶葉醇提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹作用結(jié)果

2.3 金花茶葉醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹作用的影響

皮下注射角叉菜膠后，發(fā)現(xiàn)每組小鼠足部都有不同程度的水腫，隨著時(shí)間推移，小鼠足部越來越腫，在第4 h時(shí)，小鼠的足腫脹程度最為明顯，5 h后足腫脹度逐漸變小。與空白組比較，地塞米松組、低、中、高劑量組均能夠抑制小鼠足腫脹(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組的抑制作用和地塞米松組相當(dāng)。具體結(jié)果見表3。

表3 金花茶葉醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹作用結(jié)果

2.4 金花茶葉醇提物對(duì)致炎小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量的影響

空白組與模型組比較(表4)，小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A的含量水平顯著增加(P<0.01)，說明通過使用二甲苯溶液和醋酸溶液造模后，小鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子含量增高，致炎成功。提取物各劑量組和模型組比較，低、中、高劑量組能夠顯著抑制TNF-α的含量(P<0.01)，同時(shí)，中、高劑量組能顯著減少IL-17A、IL-1β的含量，高劑量組能夠有效減少IL-6的含量。

表4 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量結(jié)果

3 討論

酚紅排泄法是藥理實(shí)驗(yàn)中一種用于篩選祛痰藥物的可靠實(shí)驗(yàn)方法。痰液作為由肺泡、氣管和支氣管分泌出來的黏液，是引起咳嗽的一個(gè)重要因素。當(dāng)其分泌量增多時(shí)，可減少對(duì)呼吸道黏膜的刺激，從而起到止咳作用。二甲苯致耳腫脹以及角叉菜膠致足腫脹都屬于急性炎癥模型，能夠復(fù)制化學(xué)因子引起的炎癥模型，常用于篩選和評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用。與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子可分為兩類：一是促炎因子，包括 IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、INF-γ、TNF-α等，二是抗炎因子，主要有IL-4、IL-10等[12]。炎癥是在各種損傷因素作用下產(chǎn)生大量促炎因子、減少抗炎因子的結(jié)果。機(jī)體產(chǎn)生的抗炎因子，能防止炎癥反應(yīng)的損傷，可促進(jìn)組織修復(fù)、對(duì)抗促炎因子的作用。

金花茶為廣西壯族傳統(tǒng)藥食資源，相關(guān)文獻(xiàn)記載金花茶可用于治療咽喉炎、腎炎等癥。且TANWAR A等[10]研究證實(shí)，茶的乙醇提取物有相當(dāng)好的抗炎作用。閻新佳[11]研究發(fā)現(xiàn)金花茶葉醇提物對(duì)內(nèi)毒素介導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞炎癥損傷具有保護(hù)作用。但關(guān)于金花茶葉體內(nèi)的抗炎作用未見文獻(xiàn)報(bào)道，其祛痰藥理研究幾乎空白。本課題首次采用酚紅排泌法以及耳、足腫脹法研究金花茶葉醇提取物的祛痰以及抗炎活性，并用ELISA法評(píng)價(jià)小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量，探討其發(fā)揮抗炎作用的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)提取物3個(gè)劑量組對(duì)小鼠氣管痰液分泌均具有一定促進(jìn)作用，能夠增加酚紅的排泌量，對(duì)二甲苯、角叉菜膠局部引起的小鼠耳、足腫脹都具有明顯緩解效果(P<0.05)，且高劑量組均優(yōu)于陽性對(duì)照組，表明金花茶葉醇提取物具有較好的祛痰作用。金花茶葉具有豐富的黃酮類成分以及茶多酚類成分，猜測該類成分可能是祛痰、抗炎的藥效成分之一，仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，金花茶葉醇提取物能夠減少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的含量水平(P<0.05)，表明金花茶葉的抗炎機(jī)制可能是通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的形成，減少細(xì)胞損傷從而保證機(jī)體細(xì)胞正常運(yùn)行而發(fā)揮作用，起抗炎作用的具體化學(xué)成分及其作用特點(diǎn)還有待后續(xù)進(jìn)一步探討。

二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于二甲苯溶液具有毒性且具有揮發(fā)性，涂抹小鼠耳朵時(shí)可能會(huì)不均勻，對(duì)小鼠耳朵造成不同程度的腫脹。涂抹二甲苯時(shí)，需要精密吸取，控制環(huán)境溫度等減少二甲苯的揮發(fā)。在角叉菜膠致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)中，剪取小鼠足部時(shí)需剪取一致的部位，同時(shí)，注射小鼠足趾部位、注射角叉菜膠的用量應(yīng)一致。ELISA實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于，給小鼠眼球取血時(shí)要避免出現(xiàn)溶血的情況，并且成功分離出較多的血清，在測定細(xì)胞因子含量時(shí)，避免出現(xiàn)點(diǎn)樣錯(cuò)誤或者稀釋錯(cuò)誤，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)、含量檢測。

4 結(jié)論

金花茶葉具有良好的祛痰作用，起作用的藥效成分以及作用機(jī)制有待深入研究，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，金花茶葉具有良好的抗炎作用，抗炎機(jī)制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的合成及釋放有關(guān)。本研究可為金花茶葉的臨床應(yīng)用及其治療物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，而且具有較好的開發(fā)價(jià)值，至于其有效成分以及藥效機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。